基于核苷碱基脂质体递送的单链小RNA修饰物生物学作用机制研究

This project aims to apply single-stranded siRNA(ssRNA), which is the guide strand of siRNA target to Braf-mRNA, to inhibit tomor cellls. Based on the previous results of isonucleotide modified siRNAs or their peptide conjugates, D-isonucleotide/2'-OMe or 2'-F-nucleotide modified and phosphorathiote-alkylated ssRNAs, or their peptide-ssRNA conjugates, will be encapsulated with neutral nucleobase-lipid(DNCA etc) combined with cationic lipid(CLD etc). The enzymatic stability and effective concentration, transfection pathway, distrabution and metabolism of the ssRNA liposomes in cell level will be investigated in detail. Structural basis of optimized ssRNA(Lead), the composition and procedures of formulations, especially thus can avoide decomposition of the ssRNAs in lysome, will be identified. The significant results could be applied further in vivo and will enhance the druggability of ssRNA.

本课题针对靶向Braf-mRNA的siRNA, 应用其主导链-单链干扰RNA(ssRNA)开展肿瘤细胞生长抑制研究工作。拟参考前期发现的siRNA异核苷酸修饰物或肽缀合物，结合自主研发的中性碱基脂质材料(DNCA)辅以阳离子脂质材料(CLD等)包载，希望针对D-异核苷酸、2’-OMe/2'-F-核苷酸及磷硫烷基化修饰的ssRNA、或肽-ssRNA缀合物，考察其包载体系的酶稳定性和有效作用浓度、跨膜途径和胞内分布代谢并初步确定代谢机制;研究活性及稳定性提高的修饰物的结构基础; 优化ssRNA先导结构及DNCA等载体制剂组分及制备工艺，发现跨膜转运能力提高并作用时间延长的ssRNA修饰物、确定能够调控入胞途径并尽可能避开溶酶体降解的制剂组分及工艺，为最终提高ssRNA的成药性奠定基础。

单链siRNA (single-stranded siRNA, ss-siRNA)指经典siRNA中发挥基因沉默作用的反义链，相较于siRNA具有更小的分子量，且避免了siRNA正义链潜在的脱靶效应，是具有前景的RNAi分子。然而，稳定性更差、基因沉默活性降低、以及作用机制尚未明确是其面临的主要问题。因此，本课题应用中性胞苷/阳离子脂材混合递送ss-siRNA，结合化学修饰提高其稳定性性，进而探究单链siRNA的作用活性、代谢分布等生物学性质和沉默机制。本研究优化了递送单链siRNA的材料配比，DNCA/CLD/siRNA摩尔比为21/31.5/1，实现了稳定高效转染，25 nM时敲低了40%靶mRNA，优于文献报道；进一步对单链siRNA进行硫代、2ʹ-修饰，作用活性显著提高，筛选出了较优的修饰模式；继续在5ʹ-端缀合磷酸基团，p-as-c序列的沉默能力提高至80%，与同修饰的双链siRNA相当；随后机制研究中，敲低AGO2蛋白表达后单链siRNA作用活性显著下降，表明其通过AGO2蛋白介导的RNAi通路发挥作用；另外发现，单链siRNA相比双链能更早达到较优的作用活性，可能源于其更快的RISC加载过程；最后，体内分布研究表明，化学修饰的单链siRNA具有较好的稳定性，体内作用时间长于未修饰序列，同时跨膜能力提高，相比双链siRNA实现了更快的全身分布。将该递送修饰策略应用于另一靶标的单链siRNA同样实现了较好的基因沉默效果，因此其有望帮助更多siRNA以仅递送反义链的形式发挥作用。.总体而言，本研究提供了一种安全高效的单链siRNA递送和修饰策略，为体内外进一步研究工作的开展奠定了基础。