TOPK在凋亡素"肿瘤选择性"凋亡诱导效应中的作用及意义的研究

Apoptin selectively induces tumor cell apoptosis, without influence on normal cells, which is regarded as a potential anti-tumor agent. Phosphorylation of Apoptin in tumor cells is essential for its action. Testifying the tumor specific apoptosis kinase will not only help to explain the mechanism of apoptin, but also promote the research of unknown event in the tumorigenesis. TOPK is a newly discovered MAPKK-like serine/threonine kinase, which is highly expressed in multiple tumors; but strictly controlled in normal tissues. Our previous in vitro kinase assay showed that TOPK can phosphorylate apoptin by in vitro kinase assay. Silencing TOPK by lentivirus could decrease the growth-inhibiting effect of apoptin in SGC7901 cell. These data clued that TOPK might be a tumor specific apoptin kinase. This project will testify that TOPK is a apoptin kinase, and clarify the significance of TOPK-catalized apoptin phosphorylation in the tumor selective apoptosis inducing effect of it. This research will explain the mechanism of apoptin and promote the antitumor agent based on apoptin, it also promotes the research of tumorigenesis and searching specific anti-tumor target.

凋亡素能选择性诱导肿瘤细胞凋亡、对正常细胞没有影响，是很有希望的抗肿瘤制剂。凋亡素在肿瘤细胞中被磷酸化修饰是其发挥作用的关键，确定肿瘤特异性凋亡素激酶不仅有助于诠释凋亡素的“肿瘤选择性”，也有助于揭示肿瘤发生的奥秘。TOPK是新近发现的MAPKK样丝/苏氨酸激酶，具有肿瘤高表达、正常组织严格限制表达的特性。本课题组预实验发现：活化的TOPK能磷酸化纯化的凋亡素蛋白；特异性沉默SGC7901细胞中TOPK，能显著降低凋亡素抑制SGC7901增殖的效率。结果提示TOPK有可能是凋亡素的激酶。本项目拟明确TOPK对凋亡素的磷酸化修饰、并阐明其在凋亡素选择性诱导肿瘤细胞凋亡中的意义。本研究将证实肿瘤特异性凋亡素激酶的存在，从而更好地揭示凋亡素作用机制和促进抗肿瘤制剂的研发，还有助于推动肿瘤发生机制和抗肿瘤药物靶点的研究。

凋亡素能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡、对正常细胞没有影响，是很有希望的广谱抗肿瘤制剂。凋亡素在肿瘤细胞中被磷酸化修饰是其发挥作用的关键，确定肿瘤特异性凋亡素激酶不仅可诠释凋亡素的“肿瘤选择性”，也有助于揭示肿瘤发生的奥秘。TOPK是一种MAPKK样丝/苏氨酸激酶，具有肿瘤高表达、正常组织严格限制表达的特性。本课题研究发现： TOPK能磷酸化凋亡素；选择可能的氨基酸位点合成肽段，开展体外肽段激酶实验发现：第89、93和108位丝氨酸，以及第56和114位苏氨酸等，都可能是TOPK的磷酸化修饰位点。为明确TOPK磷酸化凋亡素在凋亡素选择性凋亡效应中的作用，我们检测了多种肿瘤细胞中TOPK的表达，并选择部分细胞开展研究。在TOPK中等表达的Hela细胞中，过表达TOPK能显著增强凋亡素的凋亡诱导效应；而沉默TOPK，则削弱了凋亡素的作用。同样地，在TOPK中等表达的人肝癌细胞HepG2细胞中，过表达TOPK，也能增强凋亡素的凋亡诱导效应。而在TOPK高表达的人结肠癌HCT116和人胃癌SGC7901细胞中，采用慢病毒介导的shRNA技术沉默TOPK，能显著降低凋亡素的作用。此外，我们发现吉非替尼耐药的人肺癌细胞HCC827-GR，其TOPK表达水平较敏感细胞高；凋亡素能有效地诱导敏感细胞和耐药细胞凋亡，沉默耐药细胞中TOPK的水平，则削弱了凋亡素的作用。上述结果表明： TOPK是凋亡素的激酶，能在特定位点磷酸化凋亡素。在不同肿瘤中，提高TOPK水平，能增强凋亡素的作用；而降低TOPK水平则削弱凋亡素效应。表明肿瘤细胞中TOPK对凋亡素的磷酸化修饰，可能介导了凋亡素的凋亡诱导效应。本研究还在体外激酶实验的基础上，构建了凋亡素磷酸化修饰位点的激活或失活突变体，以期进一步明确TOPK对凋亡素的磷酸化修饰作用，以及在此基础上针对不同TOPK表达水平的肿瘤，优化凋亡素抗肿瘤制剂，实现更佳的抑瘤效果。本项目明确了TOPK对凋亡素的磷酸化修饰，并初步阐明其在凋亡素选择性诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。本研究将为更好地揭示凋亡素作用机制和促进凋亡素抗肿瘤制剂的研发奠定基础。