Wnt信号通路在后肠内胚层发育过程中的机理研究

The goal of this proposal is to elucidate the role of Wnt signaling in mammalian hindgut endoderm development through in vitro model of hindgut differentiation from human embryonic stem cells (hESCs). Wnt gradient plays a critical role in endoderm A-P patterning. Recent evidence showed that high level of Wnt signaling represses foregut identity and promotes hindgut fate. However, the molecular mechanism is still unclear. Our study adopted ChIP-seq and RNA-seq technologies to identify Wnt target genes during hindgut development. Our preliminary data also indicated that Wnt signaling directly regulated transcriptional activation of hindgut specific marker CDX2 and an important membrane receptor APLNR through its downstream target TCF4.Wnt signaling can not only determine hindgut endodermal cell fate through CDX2,but also may participate in the migration and morphogenesis of hindgut endodermal cells through APLNR. In addition,we found that the induction efficiency was greatly enhanced by adjusting the dose and timing of Wnt downstream pathway BMP. This study will use a combination of cell bilogy and biochemical approches. We will examine further the functions of CDX2, APLNR and other Wnt target genes in the formation of hindgut to determine the molecular mechanisms of how Wnt signaling regulates hindgut development. The outcome of this proposal will provide new insights into Wnt-related gut diseases.

本项目利用人胚胎干细胞向肠组织细胞定向分化模型，研究Wnt信号通路在后肠内胚层建立过程中的调控机制。Wnt浓度梯度的形成在内胚层前后轴的建立过程中起关键作用，高水平Wnt信号促进后肠内胚层的形成，但分子机制尚不清楚。我们结合ChIP-seq和RNA-seq技术鉴定了后肠内胚层形成过程中Wnt信号靶基因。初步研究表明，Wnt信号通过下游效应因子TCF4直接调控后肠内胚层特异标志蛋白CDX2和膜蛋白受体APLNR的转录激活。Wnt信号不仅可以通过CDX2决定后肠内胚层细胞命运，而且还可能通过APLNR信号参与内胚层细胞迁移。另外，我们发现通过对Wnt信号下游BMP信号的精细调控能显著提高分化效率。本项目将结合细胞生物学和生物化学手段，深入研究CDX2，APLNR和其它Wnt信号靶基因在后肠组织形成中的功能，阐述Wnt信号对后肠内胚层建立的调控机制。本项目的实施将为相关人类肠道疾病提供新的思路。

内胚层发育缺陷导致的先天缺陷病发病率很高（如肠道炎症性肠克罗恩病，慢阻肺等），我们对内胚层的发育及其细胞谱系建立的机制研究仍然很少。本项目通过建立体外胚胎干细胞向后肠体外定向诱导分化体系，探究了Wnt信号通路浓度梯度建立对后肠内胚层建立的调控机制。. Wnt信号抑制引起培养体系表现出显著的形态变化和肠类球体内侧上皮层细胞的命运从CDX2+转变为SOX2+。我们通过RNA-seq对分化过程中受Wnt信号调控的基因进行筛选，共找出240个Wnt信号上调的基因和2023个Wnt信号下调的基因。通过层次聚类和IPA分析，我们发现不同类别的基因表现出很大的功能差异，例如，Wnt上调的基因主要与促进消化道或肌肉系统发育相关，而Wnt下调的基因主要与抑制神经或免疫系统发育相关。此外，GO分析提示Wnt信号可促进细胞黏附过程，并激活Hh信号，反过来，Hh信号也可通过正反馈的方式促进Wnt 配体基因的表达。对RNA-seq筛选出的由Wnt信号调控的基因进行功能分析，提示Wnt信号可促进侧板中胚层和内胚层同步分化，并抑制向其它胚层分化的多潜能性。并且我们可通过ChIP-seq分析筛选出可能参与后肠形态发生过程的TCF7L2靶基因。接下来，我们将这些基因和由Wnt信号调控的基因相比较，共找到83个受Wnt信号直接调控的基因，其中包含后肠特异表达基因CDX2和一些与胚胎形态发生相关的基因（如MSX1、MSX2、LEF1、T和PDGFRB）。. 本研究通过RNA-seq和ChIP-seq分析得到一系列Wnt信号直接或间接调控的基因。对这些基因分子特性的分析也进一步说明Wnt信号通过多种转录调节方式参与hESC向后肠的分化过程。对这些基因特性的分析也进一步说明Wnt信号不仅能直接促进与后肠形态发生相关的中胚层和内胚层的分化，还可通过协调中胚层和内胚层之间的相互关系促进后肠形成。后肠内胚层体外诱导体系的建立将为研究内胚层发育机制提供良好的模型，对分子机制的深入理解也必将推动人胚胎干细胞体外诱导体系的进一步完善。