PAR-1配体与血小板整合素αIIbβ3的解离活化机制及其功能研究

PAR-1 and integrin αIIbβ3 are among the most important receptors in platelet activation and thrombosis. αIIbβ3 is capable of binding prothrombin and proMMP-1, two PAR-1 ligand precursors. Our recent publication confirmed that ADP stimulation could induce αIIbβ3-associated prothrombin activation and the formation of thrombin. Subsequent activation of PAR-1 is indispensable for ADP induced irreversible platelet aggregation. Continue on this line, we recently found αIIbβ3-associated PAR-1 ligand precursors could be agonist-specific activated, and thus constitute a previously unappreciated important yet specific supporting system in different platelet activation senario. We thus aim to clarify the disassociation and activation mechanisms of PAR-1 ligand precursors from αIIbβ3, their signaling dependence on different agonists, as well as their functions in thrombosis and haemostasis. We also aim to mapping the binding site of prothrombin/proMMP-1 and αIIbβ3, which could lay basis for the development of future interventin reagents. This project will strengthen the understanding of molecular mechanism of platelet activation and provide basis for developing novel therapeutic targets of anti-thrombotic diseases.

PAR-1和整合素αIIbβ3是血小板活化和血栓形成中最为重要的受体。αIIbβ3可以结合PAR-1受体的配体凝血酶原和proMMP-1。我们最近发表的研究已证明ADP刺激可引起αIIbβ3上结合的凝血酶原激活形成凝血酶，后者可切割PAR-1受体引起不可逆的血小板聚集。在此基础上的预实验又发现了αIIbβ3上所结合的PAR-1配体呈现刺激剂依赖性的激活，从而可能对不同刺激剂所导致的血小板活化起到特异性的支持作用。本项目拟从胞外刺激剂的选择性和胞内信号的转导机制两方面着手，深入研究凝血酶原和proMMP-1与αIIbβ3的解离活化机制，寻找它们的关键结合位点，并阐明它们的解离活化在血小板持续激活和血栓形成中的作用。我们期望为血小板的活化机制提供新的理论补充，并为新型抗血栓分子靶点的研发开拓新的思路。

PAR-1和整合素αⅡbβ3是血小板上的重要受体，在血小板活化和血栓形成中扮演关键作用。在静息状态下，αⅡbβ3与两个PAR-1受体的配体（prothrombin和proMMP-1）相结合。一旦血小板活化，prothrombin、proMMP-1与αⅡbβ3解离，进而通过切割PAR-1进一步激活血小板。本项目旨在研究prothrombin、proMMP-1与αⅡbβ3的结合位点、解离机制及其功能。首先，prothrombin、proMMP-1与αⅡbβ3的解离具有刺激依赖性。免疫共沉淀实验显示ADP只引起prothrombin与αⅡbβ3的解离，而胶原只引起proMMP-1与αⅡbβ3的解离。其次，prothrombin、proMMP-1与αⅡbβ3的解离共同依赖于PI3Kβ/Akt信号通路。利用多种小分子抑制剂（包括PI3Kα/β/γ/δ抑制剂、Akt抑制剂、p38/ERK抑制剂），发现只有PI3Kβ和Akt抑制剂能显著抑制prothrombin/proMMP-1与αⅡbβ3的解离和ADP/胶原引起的血小板聚集。再次，解离后生成的凝血酶和MMP-1通过PAR-1受体在血小板inside-out和outside-in信号扮演重要作用。ELISA实验证实ADP可引起凝血酶生成而胶原可引起MMP-1增多。血小板聚集实验发现水蛭素（凝血酶抑制剂）能抑制低浓度ADP而非胶原引起的血小板聚集，FN439（MMP-1抑制剂）只抑制低浓度胶原而非ADP引起的血小板聚集。水蛭素、FN439和SCH79797（PAR-1受体拮抗剂）都能抑制血小板在固化纤维蛋白原上的铺展。最后，虽然预测了prothrombin和proMMP-1与αⅡbβ3的结合位点，但仍未被确认。本项目的实施阐明了prothrombin、proMMP-1与αⅡbβ3的解离机制及其功能，为ADP和胶原引起的血小板活化提供了新的理论补充，并为新型抗血栓靶向药物的研发开拓了新的思路。