次氯酸修饰蛋白诱导足细胞凋亡的信号传递途径及线粒体靶向肽的保护作用

次氯酸修饰蛋白与糖尿病肾病（DN）的发展关系极为密切，但其分子机制不清楚。新近研究发现次氯酸修饰蛋白通过氧化应激诱导生物学效应，线粒体氧化应激损伤后相关信号的激活与细胞凋亡关系密切，足细胞凋亡在DN发展过程中起关键作用。因此，研究线粒体相关信号传递途径在次氯酸修饰蛋白诱导足细胞凋亡的基因调控中的作用，对阐明DN新的发病机制意义重大。Szeto-Schiller（SS）肽可通过特殊结构域在线粒体内浓集，减少局部活性氧，保护线粒体免受氧化应激损伤。本课题拟通过对糖尿病动物模型反复注射次氯酸修饰蛋白或/和SS肽后，观察其足细胞凋亡的变化和组织形态学改变，证实次氯酸修饰蛋白通过诱导足细胞凋亡促进DN形成，SS肽具有保护作用；拟应用体外培养的小鼠足细胞作为模型，研究线粒体相关信号传递途径在次氯酸修饰蛋白诱导足细胞凋亡的信号传递过程中的作用，明确SS肽对次氯酸修饰蛋白诱导的病理生物学作用的影响及机制。

次氯酸修饰白蛋白（HOCl-alb）是1996年由Witko-Sarsat及其同事在尿毒症患者血浆中发现的一类重要的蛋白质氧化修饰产物，HOCl-alb诱导的病理生物学作用与活性氧族（ROS）关系密切。本课题以人脐静脉内皮细胞和小鼠足细胞作为模型，阐明了HOCl-alb诱导血管内皮细胞和肾脏足细胞炎性因子表达通过ROS及ROS敏感的细胞内信号传递途径。.线粒体是细胞内产生ROS的重要来源，也是氧化应激最为敏感的部位，既然HOCl-alb与氧化应激关系密切，本课题重点研究线粒体氧化应激损伤与HOCl-alb诱导的病理生物学作用的关系。最近研究强调线粒体在慢性肾损伤进展中的作用，源于线粒体膜电位下降和线粒体DNA和ATP产生减少，诱导足细胞功能失常和凋亡、肾小管上皮细胞凋亡和向间充质细胞转分化，促进蛋白尿和纤维化进程。但其详细的分子机制并不清楚。近年一类新合成的小分子多肽Szeto-Schiller (SS)肽，由芳香族氨基酸残基和碱性氨基酸构成，因其具有以下特点，被认为有效的抗氧化剂：（1）以不依赖能量和非饱和的方式进入细胞；（2）有一段序列基序使之靶向作用于线粒体；（3）在极低剂量时即可以减少细胞内ROS预防细胞死亡；（4）它们进入线粒体不依赖线粒体膜电位。在单侧输尿管梗阻模型SS肽显著减少了小管凋亡、巨噬细胞浸润和纤维化；在缺血再灌注模型SS肽保护了线粒体结构和内皮细胞肿胀细胞脱落和死亡。但SS肽与HOCl-alb诱导足细胞病理生物学作用的关系不清楚。本课题研究结果表明：（1）HOCl-alb刺激足细胞12小时，细胞开始出现明显的凋亡，正常细胞比例明显下降，48小时达高峰。SS肽明显抑制了HOCl-alb诱导的细胞凋亡。（2）HOCl-alb刺激足细胞15~60min，细胞内ROS水平显著升高，表现为发出绿色荧光的细胞的百分比明显增加。SS肽明显抑制了HOCl-alb诱导ROS。（3）HOCl-alb刺激15~60min，足细胞线粒体膜电位明显下降。SS肽明显抑制了HOCl-alb诱导的膜电位改变。（4）HOCl-alb刺激足细胞2~48h，可诱导Cyto C从线粒体释放到胞质，2h为高峰。SS肽明显抑制了HOCl-alb诱导的Cyto C释放。（5）HOCl-alb 200mg/L可诱导Apaf-1和caspase-9结合。SS肽明显抑制了HOCl-alb诱导的