类胡萝卜素代谢途径转录调控基因与代谢节点的挖掘

The structral genes of carotenoid metabolic pathway in plant have been well studied , but the regulatory molecular mechanisms were unclear and fewer regulatory genes were identified so far. Dunallila salina could accumlute up to 10% beta-carotene when suffered stress conditions such as nutrition starvation, high light and high salt. Therefore, using "Omics" methods to mine the regulatory genes and metabolic regulatory nodes of the beta-carotene metabolism pathway in Dunalliela salina would be helpful in elucidating the molecular regulatory mechanism of carotenoid metabolism. At present project, transcriptomic technique RNA-seq and metabonomics were adopted to interrogate the difference of gene expressions and metablites in genome and whole cell scales, respectively. A medium containing limited nitrogen, phosphate and sulfor has been constucted previously and used in this project, there time points (nutrition replete, nutrition deplete and sarvation for 5 days) were selected. Gene functional annotion, gene diferential expression, pathway gene function clustering, construction of pathway regulatory network, pathwau rate-limiting step, the gene function identification by genetic overexpression in Dunalliela salina will be performed in this project.

植物类胡萝卜素代谢途径各步的催化酶及其编码基因已研究地较为清楚，但对其代谢调控机制了解甚少。杜氏盐藻（Dunaliella salina）具有特殊的类胡萝卜素代谢机制，环境胁迫时可积累干重10%以上的β-胡萝卜素，是研究类胡萝卜素代谢调控的良好物种。本项目旨在利用转录组与代谢组学技术挖掘盐藻β-胡萝卜素代谢调控中的调控基因与代谢节点。首先利用培养基中氮、磷、硫营养因子的含量变化来创造不同的营养饥饿条件，诱导β-胡萝卜素不同水平的积累，然后对处于不同营养饥饿条件、β-胡萝卜素含量差异巨大的盐藻细胞进行RNAseq测序与代谢组分析，通过Unigene库构建、基因功能注释、差异表达基因与代谢节点分析、GO功能与pathway显著性富集分析、转录因子预测、代谢途径结构基因表达分析与代谢途径间的调控网络构建方法挖掘出潜在的关键调控基因与代谢节点，最终通过遗传转化与表型分析进行基因功能与代谢节点验证。

本项目旨在利用多组学技术挖掘盐生杜氏藻(Dunaliella salina)在胁迫条件下快速积累β-胡萝卜素过程中的关键调控基因与调控机制。首先研究了D. salina对氮元素、硫元素、磷元素及其四种元素组合饥饿条件下的生理响应规律，包括β-胡萝卜素、叶黄素积累规律、光合效率以及类胡萝卜素合成途径关键酶编码基因的响应规律。结果表明：不同饥饿胁迫条件下，氮饥饿胁迫(-N)的生理效应最为明显，其次是磷饥饿胁迫(-P)，而硫饥饿胁迫(-S)仅在生长前期影响较为显著。多营养饥饿胁迫共存时，对生理生化的影响效应加强。营养胁迫发生后细胞先利用胞内储存的营养维持生长，当胞内营养耗尽后，生长减慢直至停止。类胡萝卜素合成途径中关键酶基因表达水平的研究结果表明，虽然-N-P、-N-S、-N-P-S条件下，类胡萝卜素及β-胡萝卜素的含量相比单独营养饥饿均有明显提高，但合成途径中关键酶基因的转录本水平并未相应增加。通过深度测序技术（RNA-seq）与GC-MS分析获得了D. salina在-N、-S与-P以及正常营养培养条件下的转录组与代谢组数据。获得了87,160,704 有效reads，平均长度为124.94 bp. 组装后产生 73,329 转录本，转录本平均长度801 bp，47,283个unigenes，平均长度 675 bp. 功能聚类分析表明， 5,803 unigenes 分配到 50个 GO term 中，包含三个大的功能类。通过与KEGG数据库对比，涉及1,438 酶类别， 252 代谢途径。差异表达基因分析表明差异表达基因（DEG）主要为光合作用相关基因，β-胡萝卜素途径基因以异构酶编码基因。PCA分析与Cluster分析表明营养胁迫下D. salina细胞中碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢相关物质含量发生了显著改变。不同营养胁迫检测到的代谢物种类类似，主要的标记性代谢物为脂肪酸、氨基酸和糖类，例如十六烷酸、脯氨酸和蔗糖等。其中硫饥饿严重抑制了尿素代谢水平。三种营养共饥饿对TCA循环、尿素循环及氨基酸的合成均造成抑制。胁迫条件下，细胞活性保护物质，如脯氨酸、谷氨酸和某些单糖，及蔗糖、脂肪酸的含量，均显著提高，并且胞内的2-酮戊二酸的含量均显著增加，有明显转向类胡萝卜素合成的趋势。同时通过对比雨生红球藻虾青素积累过程代谢物变化，构建了绿藻类细胞胡萝卜素代谢调控网络。