葛根素核酸适体的筛选及其在分离提纯检测方面的应用研究

Puerarin，one of the functional factors of pueraria isoflavonoids, has a good value in medical and health care, but the limitations of production technology has restricted its better development and utilization. We will screen the aptamer of puerarin and study on how to obtain aptamer having high affinity, high specificity and good reproducibility by SELEX in this project. The action mechanism and the binding domain of aptamer binding with puerarin will be explored, and the selected aptamer will be optimized and finally the best aptamer is found. We explore the optimum process of the solid phase extraction technology having the aptamer as the adsorption material, and apply this technology to achieve the separation and purification of prerarin from crude isoflavonoids and the radix puerariae starch industrial waste water. Finally we study on the mechanism of signal amplification enzyme-linked aptamer detection and design a suitable detection strategy based on binding domain aptamer, and explore the application of this method in the detection of puerarin in real samples.

葛根素属异黄酮类物质，是葛根中的一种重要的功能因子，具有很好的药用及保健价值，但由于生产技术的局限，限制了其开发利用。本项目拟通过SELEX技术筛选葛根素的核酸适体。研究如何通过SELEX技术获得高亲和力、高特异性和重现性好的核酸适体；研究核酸适体与靶标的作用机制和核酸适体的结合域；对筛选获得核酸适体进行优化研究，选出最优核酸适体。探索核酸适体做吸附材料的固相萃取技术的最佳工艺流程，并将其应用于粗品葛根素分离提纯及生产葛根淀粉的工业废水中葛根素的分离提纯。探索酶联核酸适体信号放大检测机制，依据适体结合域的特征，设计合适的检测策略，探索该方法检测实际样品中葛根素的应用性。

核酸适体（Aptamer）是单链 DNA 或者 RNA ，作为新型理想分子识别探针，具有常规识别元素（抗体和酶）所不具备的一些优点。核酸适体在生物学和医学中的应用已受到广泛关注，但尚未用于中药研究。本项目将核酸适体应用于中药开发，以葛根素为靶标，首先筛选核酸适体，然后探索适体在分离及检测方面的应用。通过SELEX技术（主要是重复性的操作，一轮一轮的筛选实验。就是结合、分离、PCR扩增、单链制备、再筛选等等这样一个循环过程），筛选葛根素小分子靶标的核酸适体，完成了筛选条件的优化，经过九轮筛选获得了富集文库。对富集DNA文库进行测序，对测序回来的100条适体序列进行了性能和结构分析，包括序列的同源性、二级结构相似性、和靶标的结合能力、结合效率、结合的平衡解离常数、特异性等，发现SSd8、SSd11、SSd17三条序列结合能力较强，平衡解离常数数值分别为0.25、0.16和0.57μmol/L。对性能较好的两条序列进行结构鉴定及剪裁分析，最终确定出两条性能优异的适体序列：SSd1134nt：CGACGTACGTGCGTCCGTACTCTGGTCTGGTCGG和SSd820nt：CGTGCATAAGTGTACAACCA。后续以这两条序列为基础，发展了酶联核酸适体分析方法检测葛根素： SSd1134nt序列做识别分子的引入放大策略的方法1，检测限为 0.3nmol /L；SSd820nt序列做识别分子的方法2，检测限为0.23μmol/L。以血清和废水为基质，进行添加回收实验，方法1的平均回收率为85.8～93.7%，相对标准偏差为1.76～4.65%，方法2的平均回收率为87.2～97.5%，相对标准偏差为1.32～3.01%。两种方法都能用于实际样品检测，检测生产葛根淀粉的废水、中成药葛根素制品以及分离葛根素后提取液中的葛根素都取得了良好效果。酶联适体分析方法检测葛根素，简单方便、无需复杂的样品前处理步骤，无需大型检测设备，有广阔的应用前景，未来有可能代替HPLC法做常规检测。将适体SSd1134nt和SSd820nt偶联到琼脂糖珠上，发展了基于萃取微型柱和离心分离的两种固相萃取方法，回收率在93-98%之间。该方法能用于生产葛根淀粉的废水、中成药葛根素制品以及分离葛根素后提取液中葛根素的回收。