利用Dual RNA-sep研究猪瘟病毒与宿主转录组相互作用的分子机制

Classical swine fever (CSF), classiified as highly pathogenic animal disease, is one of the priority prevention animal diseases in China. Investigation pathogenic mechanism through molecular point of view is an important technique tool to control and eradicate CSF. Dual RNA-seq based transcriptome analysis can not only compare differentially expressed genes (DEGs)in pigs infected with different virulence CSFV strains, but also analyse different viral gene products during the stage of infection, therefore, to directly and accurately understand host-virus interaction. To demonstrate molecular mechanism of host-CSFV interaction, the present project plan to analyse host and virus mRNA expression as well as small non-coding RNA expression in pigs infected with mild, moderate orvirulent strains. Tissues from tonsil, submandibular lymph nodes and kidney will be collected during different stages of infection for dual RNA-seq to identifyGO annotations and KEGG pathways that may affect host-virus interaction. Subsequently, key DEGs involved in viral virulence, pathogenesis and immune responses will be validated and host-CSFV interaction network will be established. This project will provide direct and detailed insight into mechanism of CSFV pathogenesis and help us to better understand how live attenuated CSF vaccine works.

猪瘟是我国优先防范的重大动物传染病，开展CSFV致病机理的研究是防控猪瘟的重要技术手段。基于dual RNA-seq技术的转录组分析不仅能在核苷酸水平平行比较不同毒力CSFV感染后组织中差异表达的基因，还能分析在不同感染阶段病毒基因表达产物的差异，从而更准确的揭示病毒与宿主之间的相互作用。为阐明猪瘟病毒与宿主转录组相互作用的分子机制，本项目通过采集不同猪瘟感染模型的扁桃体、颌下淋巴结和肾脏等嗜性组织，应用新型dual RNA-seq技术对宿主转录组、病毒基因组以及非编码RNA小分子表达情况进行分析，利用DGE找出CSFV感染后与病毒毒力、免疫反应、致病性等相关的重要宿主和病毒的差异表达基因，同时进行GO功能注释和KEGG pathway富集分析，鉴定出与毒力、免疫和致病性相关的关键基因，构建猪瘟蛋白互作网络，为阐明CSFV的致病机理及疫苗免疫机制提供准确、详实的科学数据。

持续感染是造成我国猪瘟长期存在和散发流行的主要因素，究其原因可能与猪瘟兔化弱毒疫苗C株的普及免疫使 CSFV 的抗原谱发生变化，导致猪瘟病毒遗传演化和慢性猪瘟及非典型猪瘟的流行，也是目前猪瘟防控工作中最大的难点。本项目利用CSFV强毒SM株、中等毒力流行毒HuB100/2017株及C株分别感染PK-15细胞和SPF仔猪后利用dual RNA-seq 技术进行体外、体内病毒与宿主转录组互作测序分析，使用DGE找出CSFV感染后与病毒毒力、免疫反应、致病性等相关的差异表达基因，同时进行GO功能注释和KEGG pathway富集分析等，结果显示：细胞水平上C株与HuB100/2017相比，差异表达基因富集到了甲状腺激素信号通路、Pl3K-Akt信号通路、紧密连接蛋白表达通路等相关通路；C株与SM株相比，差异表达基因被富集到代谢相关通路、核糖体、维生素代谢和生物质能代谢相关通路；HuB100/2017株与SM株对比中未发现差异基因以及共同显著富集炎症因子、细胞因子等相关通路。在体内研究中，C 株免疫后多器官组织中在先天免疫调节中发挥重要作用的RIG-I基因均出现上调表达，组织病理学及病毒组织嗜性研究结果表明：SM株、HuB100/2017株感染后淋巴结、肾脏等组织出现充血、出血、淤血为主的病理变化；而在免疫组织化学（IHC）检测中，主要在淋巴结、十二指肠及回盲瓣中病毒蛋白阳性信号较为明显，上述结果也与定量qPCR方法对相应组织中CSFV E2基因载量的检测结果基本一致。C株接种后不同时期采集的9种组织经HE染色和IHC检测均未观察到明显病理变化和检测到E2蛋白阳性信号，说明C株疫苗依然是一株安全、有效的弱毒疫苗。. 通过新型的dual RNA-seq技术对不同毒力CSFV感染后宿主转录组、病毒基因组以及非编码RNA小分子表达情况进行分析，准确、详实的掌握了不同毒力CSFV感染后在致病性、免疫反应等相关宿主和病毒基因组差异表达的基因，为今后深入研究CSFV的致病机理以及猪瘟疫苗产生免疫保护力的原因提供准确、详实的科学数据，也为全面揭示不同毒力CSFV对猪产生不同致病力的分子机制奠定理论基础。