苗药香囊活性成分鉴定及通过TLR-MyD88-NFκB通路上调呼吸道免疫力的作用机制研究

Respiratory tract infections are always important issues that threaten human life and health, and become medical research focus in recent years after the flu outbreak. Miaoyao Fanggan Sachets (MFS) have long been used as a folk medicine for the effective and cheap prevention of seasonal influenza in the Southeast of Guizhou Province. Toll-like receptors (Toll-like receptors, TLRs), the most important pathogen associated molecular patterns receptors, recognize pathogen pattern molecules that induce signal transduction leading to the release of inflammatory factors and interferons through the MyD88 pathway. Preliminary studies suggested that MFS significantly enhanced TLR2/4 expression levels and regulated innateimmune potency in mice. This study plans to examine the mechanisms of action associated with MFS enhancing immunity of respiratory tract from the TLR-MyD88-NFκB pathway. Then we will screen 1-2 high effective and low toxic single active compounds as respiratory tract ImmunoEnhancer by using supercritical fluid carbon dioxide extraction plus mass spectrometry and combined with the evaluation of acute toxicity test. This study will lay a foundation for the development of new drugs to improve the immunity of respiratory tract with clear mechanism.

呼吸道感染一直是威胁人类生命健康的重要问题，尤其是近年来流感爆发使其成为医药卫生研究的热点。苗族民众佩戴香囊是一种有效、方便、廉价的预防呼吸道感染方法。Toll样受体( Toll-like receptors,TLRs)是最重要的模式识别受体，对病原体模式分子进行识别引发的信号转导导致炎症介质的释放,并能经MyD88通路强效地调控着抗感染免疫。前期研究提示小鼠吸入苗药香囊能刺激其肺组织内TLR2/4表达上调。本课题拟在前期研究的基础上，从TLR-MyD88-NFκB通路为切入点进一步研究苗药香囊发挥作用的药理机制。然后利用超临界流体CO2萃取法加分子蒸馏法加质谱分析法分离、鉴定出单体活性化合物；通过生物活性测试结合急性毒性评价，筛选出1-2个提高呼吸道免疫力活性高、毒性低的生物活性成分。为研制效应物质基础清楚、效应确切、作用明确的提高呼吸道免疫力的新型药物奠定基础。

呼吸道感染非常常见，且极大地威胁着人类的健康和社会发展，由于新病原体的出现、病原变异等不容忽视的因素。新型呼吸道疾病大流行的威胁一直存在，因此，有效防控呼吸道感染的研究亟需加强。因此急需找到一种有效、廉价地预防方法。而中医“香佩疗法”的香囊恰好有希望解决这一问题。 .研究中，以昆明种雄性小鼠为模型，采用冷刺激法探讨苗药香囊（香囊）对小鼠呼吸道TLR—MyD88—NF-κB通路多位点的研究。发现苗药香囊组、匹多莫德组、苗药香囊+匹多莫德组小鼠肺组织中MyD88、Traf6、NF-κB （P65）表达增加，与空白组比较差异有统计学意义（P﹤0.01）。苗药香囊冷刺激组、匹多莫德冷刺激组、苗药香囊+匹多莫德冷刺激组小鼠肺组织中MyD88、Traf6、NF-κB （P65）表达增加，与冷刺激组比较差异具有统计学意义（P﹤0.01）。香囊能够上调肺组织中MyD88、Traf6、NF-κB（P65）的基因和蛋白表达，能够增强机体局部固有免疫功能，有效预防呼吸道感染。 .以MyD88基因敲除小鼠和人正常肺上皮细胞 (BEAS-2B)为模型，阐明苗药香囊（香囊）通过TLR-MyD88-NFκB通路提高呼吸道免疫力的机理。发现免疫组化、RT-PCR、Western Blot检测结果提示,与空白对照组相比，香囊组（MFS组）小鼠肺组织上述分子的基因和蛋白表达水平升高（P<0.05）；MyD88-KO组、MyD88-KO+MFS组小鼠肺组织上述分子的基因和蛋白表达水平减低（P<0.05）；与MyD88-KO组相比，MyD88-KO+MFS组小鼠肺组织的表达水平稍升高（P<0.05）。说明MyD88可能为香囊调节呼吸道免疫力的关键因子，香囊可通过增强MyD88表达，激活TLR-MyD88-NFκB信号通路，并刺激下游细胞因子的释放起到免疫调节的作用。.应用微谱技术分析了苗药香囊提取物中有：癸酸、甘草酸铵盐、微量β-蒎烯、P-伞花烃成分。据此，我们正在做甘草酸铵盐对呼吸道免疫调节的研究。 .该项目进展顺利，已经基本完成既定研究目标。阐明了苗药香囊通过TLR—MyD88—NF-κB通路对小鼠呼吸道免疫的影响机制。并为研制效应物质基础清楚、效应确切、作用明确的提高呼吸道免疫力的新型药物奠定基础。