全局性调控子GacA对假单胞菌L-肉碱生物合成的调控机制研究

L-carnitine (alternate name is vitamin BT) plays important roles in fatty acids metabolism, and is used as an effective ingredient in pharmaceuticals and foods. The increasing demands for L-carnitine has turned microbiological production of this chemical a research hotspot. Nevertheless, the regulation network and mechanisms concerning L-carnitine biosynthesis in native strains remained unknown. This proposal aims to perform studies in an isolated Pseudomonas strain that can convert γ-butyrobetaine into L-carnitine, in purpose of revealing the regulation pattern of GacA, which is believed to be a positive regulator in L-carnitine production. LacZ reporter system will be constructed for detection of roles of GacA and its downstream partners on expression of bbd and cdh, genes encoding two key enzymes in L-carnitine biosynthesis pathway. The effects of GacA overexpression or deletion on L-carnitine production will be investigated in fermentation experiments, and in vitro Protein-RNA binding shift assay will also be carried out to fully characterize the the regulation mechanism. The proposal, therefore, will not only help us in better understanding of cellular mechanism in L-carnitine biosynthesis, but will also stimulate better strategies in strain designs and bioengineering for robust production of L-carnitine.

L-肉碱(左旋肉碱) 是一种维生素制品（维生素BT），能促进动物体内脂肪酸的代谢，被广泛应用于医药和食品领域。如何提高生物合成L-肉碱的产量是目前研究的热点，然而微生物体内L-肉碱合成的调控网络和机制尚缺乏深入的探讨。申请人筛选到一株能以γ-丁基甜菜碱为底物合成L-肉碱的假单胞菌株，实验发现全局性调控因子GacA正调控L-肉碱的产量，但具体调控机制不清楚。本项目将在成功克隆L-肉碱合成相关基因的基础上，深入开展L-肉碱合成通路的基因表达和调控研究，首先确定GacA及下游调控蛋白对L-肉碱合成关键基因bbd和cdh的调控水平（转录或转录后），进一步通过构建lacZ报告子融合表达、qRT-PCR和EMSA等研究调控蛋白对bbd和cdh基因表达的调控位点等特征，阐明GacA对L-肉碱合成与代谢途径的调控机制，为构建高效生产L-肉碱的基因工程菌提供理论依据。

L-肉碱即左旋肉碱（英文简称：L-car），又叫维生素BT，是一种广泛存在于动物、植物以及部分微生物体内的活性异构体，其主要功能是参与脂肪酸的代谢。近年来，L-肉碱的生物合成法是一大研究热点。.许多微生物都有能将巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱和D-肉碱（英文简称分别：crot、γ-BB和D-car）等一些物质转化为L-肉碱的能力。本课题分析假单胞菌和大肠杆菌体内产L-肉碱的代谢过程途径发现，假单胞菌能将γ-丁基甜菜碱发酵生成L-肉碱，大肠杆菌能转化巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱。为了研究L-肉碱的代谢调控以进一步提高L-肉碱的产量，从筛选到的假单胞菌和大肠杆菌野生型出发，通过基因工程改造，比如过表达和基因敲除，构建得到稳定高产L-肉碱的基因工程菌株。主要研究工作及结果有：.（1）假单胞菌基因组上敲除肉碱代谢酶基因cdh并过表达合成酶基因bbh，得到pf5Δcdh/bbh菌株，在含有γ-丁基甜菜碱的发酵液中进行发酵时，最后产量为2.5 g/L左右。而全局性调控子GacA突变之后，几乎不产L-肉碱。.（2）将大肠杆菌野生株BW25113基因组上编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因删除得到大肠杆菌突变株BWΔaceK，选择厌氧诱导的质粒pET-A以及IPTG诱导的质粒pACYCD，分别插入caiBCD片段以及caiT和caiF，分别得到第一个过表达质粒pEH-caiBCD和第二个过表达质粒pACYCD-caiT-caiF；将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌突变株BWΔaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWΔaceK/(pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。同样方法构建T7启动子控制下的过表达质粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF，转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行过表达。.（3）通过IPTG诱导及厌氧诱导优化后，使酶活和菌体达到最优化，然后利用全细胞酶促转化巴豆甜菜碱生产L-肉碱。最后L-肉碱的产量达到30 g/L，摩尔转化率达到42%。