伪狂犬病毒IE180 3'UTR区G-四链体结构及其在病毒复制中的作用

Guanine rich sequences may form a special nucleic acid secondary structure called G-quadruplex, which plays an important role in the replication, transcription and translation of genes. Pseudorabies virus (PRV) is an important pathogen hazarding the pig industry. In our previous study, we discovered that the 3'UTR of PRV immediate early gene IE180 contains a consecutive four G-quadruplex sequence, which can form G-quadruplex confirmed by circular dichroism analysis, but the biological significance of viral infection is unclear. The project intends to solve the crystal structure of G-quadruplex, and reveal the overall three-dimensional structure of 3'UTR in IE180 through small angle diffraction and electron microscopy. To analyze the influence of G-quadruplex on the function of 3'UTR in regulating transcription and translation, the G-quadruplex ligands and the 3'UTR mutant without the G-quadruplex forming sequence would be designed on the basis of the structure. The recombinant PRV containing the mutant 3'UTR could be constructed through CRISPR/Cas9 system, and this project would evaluate the effect of G-quadruplex in 3'UTR on the transcription and translation of IE180, and viral replication. This could explain PRV replication mechanism from a new perspective, and provide a theoretical basis for new drug development.

G-四链体是由鸟嘌呤富积序列形成的特殊核酸二级结构, 在基因的复制、转录和翻译中发挥重要作用。猪伪狂犬病毒（PRV）是危害养猪业的重要病原。我们的前期研究发现，PRV立即早期基因IE180的3'UTR上含有可形成4个连续G-四链体的序列，并通过圆二色谱分析证实这些序列可折叠成G-四链体结构，但其在病毒感染中的生物学意义尚不清楚。本项目拟进一步解析这些G-四链体的晶体结构，并采用小角衍射、冷冻电镜等方法，揭示IE180 3'UTR整体的三维结构；基于结构设计G-四链体小分子稳定剂和不能形成G-四链体的3'UTR突变体，分析G-四链体形成对3'UTR调节转录、翻译的影响；利用CRISPR/Cas9系统构建3'UTR G-四链体序列突变的重组PRV，从病毒水平上评价3'UTR G-四链体的形成对IE180转录、翻译以及病毒复制的影响，从新的角度解释PRV复制机制，并为新型药物开发提供理论依据。

项目背景. 伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒(PRV)引发的人畜共患病，具有嗜神经性和潜伏感染性，可引起母猪流产、公猪不育、新生仔猪死亡。同时，最新研究发现PRV可使人患病毒性脑炎。深入研究PRV潜伏感染以及发病机制，控制伪狂犬病爆发，有助于保障畜牧业生产和人民健康。.该病毒基因组中GC含量高达74%，但这个高GC含量序列的功能却未可知。鸟嘌呤富集序列可折叠成特殊的G-四链体结构，该结构在基因组中的形成和解旋影响基因复制、转录、翻译或重组等过程。揭示G-四链体结构形成或解散对PRV生命周期的调控机制，探索靶向特定G-四链体结构开发抗病毒药物，有望为病毒防控提供新机遇。..主要研究内容及重要结果. 本项目在PRV唯一立即早期基因IE180 3'UTR 区鉴定出保守的G-四链体可形成序列，这个G-四链体结构的形成不影响转录，但促进翻译；筛选到破坏该G-四链体结构的抗病毒小分子TMPyP4，将该校分子加入到感染PRV的PK15细胞，可降低IE180的翻译,并抑制病毒增殖（RNA Biol. 2020; 17(6):816，封面文章）；采用长波长反常散射解析了IE180 3'UTR G-四链体与小分子复合物的晶体结构（Nucleic Acids Res. 2020;48(17):9886）；通过分子动力学模拟，解析小分子TMPyP4解开G-四链体结构机制。机制的明晰有利于基于机制设计抗病毒抑制剂。..科学意义. 目前，大部分疫苗研发和抗病毒药物分子设计都是基于蛋白功能和结构而开展的。该研究为第一个分析农业领域病毒基因组中G-四链体功能的工作，提出病毒可利用宿主提供的外界条件（细胞的酸碱性、离子、代谢物以及蛋白）调控G-四链体稳定性，进而影响基因表达，这为研究病毒基因组中高GC含量序列的功能，揭示核酸调控病毒增殖、潜伏感染机制以及开发靶向核酸的抗病毒药物提供新思路。