铁蛋白在牙周炎发生发展及组织修复中的作用及其机制研究

Previous full length cDNA library analyses about active genes in the human periodontal ligament (PDL) revealed aboundant expression of ferritin. The periodontal ligament (PDL) is a specialized connective tissue interposed between the roots of teeth and the inner wall of tooth-supporting bone (alveolar bone). The PDL links the teeth to the alveolar bone proper, thereby providing support, protection and sensory input for the masticatory system. It has also been demonstrated that PDL tissues contain multipotent mesenchymal stem cells that can differentiate into mineralized tissue-forming cells, such as osteoblasts and cementoblasts. Thus, the PDL is thought to play crucial roles for not only homeostasis of periodontal tissues but also bone remodeling, wound healing and tissue regeneration. Further immunohistochemical staining of mouse found that predominant expression of ferritin in gingival epithelium and gingival connective tissue, especially in junctional epithelium.Cytosolic ferritin is a ubiquitous and highly conserved iron storage molecule that is composed of ferritin heavy polypeptide (FTH) and ferritin light polypeptide (FTL). Twenty-four ferritin subunits assemble to form the apofferitin (iron-free ferritin) shell. The FTL and FTH subunits are encoded by separate genes and their functions are nonexchangeable. Many reports have demonstrated that ferritin has an important biological role in the immune response, oxidative stress response and the inflammatory response. Recent research showed that ferritin involves in osteoblast differentiation. The purpose of this study is to investigate the effect of ferritin on cytodifferentiation of periodontal ligament cells, gingival epithelial cells and gingival fibroblast cells in vitro as well as the role and mechanisms involved in the etiology and progress of periodontitis and also repair of periodontal defect.

申请者用全长cDNA文库分析人牙周膜组织中功能活跃基因时发现铁蛋白表达丰富。牙周膜为牙齿提供支持、营养、缓冲、感应及保护，在牙周组织代谢及再生中发挥重要作用。进一步小鼠组织学研究发现铁蛋白在牙龈上皮，尤其结合上皮中的表达非常高，牙龈上皮在控制微生物感染、保护上皮下组织和维持牙周组织稳态具有非常重要的作用。铁蛋白普遍存在于各种组织中且高度保守，是最主要的铁储存和调节蛋白。铁蛋白不仅对于维护细胞中铁离子的代谢平衡至关重要，其在免疫反应，氧化应激反应及炎症反应中也具有重要的生物学作用，近来有研究报道铁蛋白还具有调节成骨细胞分化的功能。由此假设：在牙周组织中高表达的铁蛋白在牙周炎发生发展及修复中发挥重要作用。因此，本研究拟在前期工作的基础上通过横、纵向临床研究、体外细胞分子生物学实验及牙周炎动物模型，深入研究铁蛋白对牙周组织细胞生物学特性的影响及铁蛋白在牙周炎发生、发展及组织修复中的作用及其机制。

牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性感染性疾病。目前牙周炎的致病机制尚不明确。全长cDNA文库分析发现铁蛋白在人牙周组织中表达非常丰富。牙周炎患者血清、唾液、龈沟液中铁蛋白含量增多。铁蛋白是普遍存在于各种组织中且高度保守的一种铁结合蛋白，与炎症密切相关。本项目首先采用免疫组化实验、细胞免疫荧光实验和RT-PCR水平凝胶电泳实验检测铁蛋白在人牙龈组织，食蟹猴牙和牙周组织，以及五种原代培养细胞（人牙周膜细胞、人牙龈上皮细胞、人牙龈成纤维细胞、人牙髓细胞、人根尖乳头细胞）中的表达情况；然后利用免疫组化学实验检测人炎症性牙龈组织和实验性牙周炎小鼠牙和牙周组织中铁蛋白的表达特点和定位，并使用Realtime PCR, Western Blot, ELISA检测体外致病因素牙龈卟啉单胞菌脂多糖和体内促炎因素IL-6、TNF-α是否为引起牙周局部铁蛋白升高的原因；最后使用细胞外铁蛋白因子，特异信号通路抑制剂和基因沉默技术检测细胞外铁蛋白对牙周膜细胞炎症反应的影响，并明确铁蛋白的作用受体和涉及的细胞信号通路。主要结果：（1）铁蛋白在牙周膜、牙龈上皮和牙龈结缔组织中表达非常丰富，尤其在牙周膜组织中；（2）实验性牙周炎小鼠牙周组织中铁蛋白的表达随着局部炎症的加重而升高；（3）牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）呈时间和剂量依赖型促进人牙周膜细胞内铁蛋白的表达；（4）体内促炎因子IL-6和TNF-α同样促进人牙周膜细胞内铁蛋白的表达；（5）牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）促进人牙周膜细胞分泌铁蛋白；（6）去铁铁蛋白（Apoferritin）呈剂量依赖型促进牙周膜细胞IL-6和IL-8的分泌，发挥促炎功能；（7）转铁蛋白受体和ERK，P38 MAPK信号通路参与铁蛋白的促炎过程。本项目在前期工作的基础上通过临床样本分析、体外细胞分子生物学实验及牙周炎动物模型，研究铁蛋白作为宿主因素之一对牙周炎发生发展过程产生的影响，为铁蛋白成为检查牙周炎的分子标记物和治疗牙周炎的作用靶点提供理论基础和依据，为牙周炎的预防和治疗提供新思路。