鱼类miRNA-1和miRNA-133在肌肉生长和发育中的遗传分析

microRNAs are small non-coding RNA molecule found in plants and animals that play important functions in transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression. The microRNA research has become one of the hot topic in molecular biology. Recent studies have identified several microRNAs including miR1 and miR133a that are specifically expressed in muscle cells and have been suggested to play a critical role in muscle development and growth. However, no gene knockout studies have been reported for miR1 and miR133a in any model system. We propose here to use zebrafish as a model to carry out genetic, molecular and cellular studies to determine miR1 and miR133a function and mechanism of actions in fish muscle development and growth. The specific aims are: (1) using TALEN and Cas9 technologies to mutate miR-1 and miR133a genes in zebrafish, and to study their functions in muscle development and growth; (2) Analysis of transcriptome profile in control and miR1/miR133a mutant fish to identify the miR-1 and miR133a target genes; (3) analyses of Pax7 expression and muscle stem cells (satellite cells) proliferation and differentiation in miR1/miR133a mutant fish to elucidate the molecular and cellular mechanisms of miR-1 and miR-133a function in regulating gene expression and skeletal muscle growth.

MicroRNA作为非编码小RNA分子在转录和后转录水平调控基因表达过程中发挥重要作用，成为当前分子生物学的研究热点之一。近期已证实某些microRNA包括miR1和miR133a 在肌肉细胞中特异表达，它们可能对肌肉生长和发育很关键，但是目前并没有任何模式系统敲除miR1和miR133a的报道。本项目拟采用斑马鱼为研究对象，采用分子遗传和细胞学方法来研究miR1和miR133a的功能和肌肉生长和发育的作用机制。本研究主要目标为：（1）采用TALEN 和Cas9技术敲除斑马鱼miR-1/133a，研究它们在肌肉发育和生长中的功能；（2）构建胚胎发育转录组表达谱，分析和鉴定miR-1/133a靶基因；（3）利用miR1/miR133a突变系来分析Pax7的表达和肌肉干细胞（卫星细胞）的增殖和分化，从而阐明miR-1 和miR-133a调控基因表达和骨骼肌生长的分子和细胞机制。

已有一些小RNA被证实在心肌和骨骼肌里特异表达而被命名为肌小RNA。这些在肌肉特异的小RNA由三个不同的基因簇组成，包括miR-1, miR-133a/b 和miR-206 家族。miR-1 和 miR-133a 都能够在心肌和骨骼肌表达，他们成熟态的mir-1 和mir-133a 都完全一致；而同源的miR-206/133b 簇都只能在骨骼肌里表达。为了检测鱼类肌小RNA在肌肉生长和发育中的生物功能，我们通过采用TALEN和 CRIPSR/Cas9 技术系统敲除斑马鱼肌小RNA的三个家族成员miR-1, miR-133 和miR-206。目前我们成功敲除了miR1-1 , miR1-2, miR133-a1 , miR133-a2, miR206-1 和 miR206-2 等6个肌小RNA。我们发现失去功能后的mir-133-a1 和miR206-1的斑马鱼成活率显著下降，miR206-1突变体体重和大小都偏小。与此相相反，纯合的miR206-2, miR1-1, miR1-2 和 miR133-a2 突变体未见任何明显表型，与野生型无异。当前我们正在整合双突变和三突变，并以此作为背景敲除mir-133b 和 mir-133c 两个额外的肌小RNA以期能够阐明这些肌小RNA在肌肉生长和发育中的功能差异和协同作用机制。. 此外，我们研究了饥饿影响鲫鱼（goldfish）肌肉中的MicroRNAs (miRNAs) 表达节律。在我们选取的70种miRNAs中，有15 种呈现出有规律的日常节律变化。通过7天和15天饥饿处理实验鲫鱼后，分别有23种和18种miRNAs表现出生理节律波动。特别注意的是有四种miRNAs：miR-23a, miR-29, miR-199a-3p 和 miR-455 在饥饿0天，7天，15天都表现出日常节律变化。我们的研究表明不同的进食刺激可能会变更在骨骼肌中表达的某些具有生理节奏化的MicroRNAs组成和它们的表达谱。我们认为这些节律microRNA在鱼类营养源改变情况下，可能在调节与肌细胞分化相关基因等生理过程中扮演重要的角色，因此在水产养殖中有一个潜在的应用价值。