新疆出血热S基因和M基因编码蛋白的抗原性研究

新疆地区的克里米亚-刚果出血热(CCHF)，又称为新疆出血热（XHF）。其病原体CCHFV地理分布广泛，对人的致死率高达50%，因此确定该病毒的抗原表位，对XHFV感染的诊断和治疗研究具有重要的意义。本研究对来自新疆不同地区和宿主的新疆出血热病毒全基因组序列进行分析比较，对S基因和M基因编码蛋白进行全长和分段克隆表达、纯化，以此制备蛋白质芯片，对新疆出血热患者血清和染疫动物血清进行抗体谱的研究，综合分析反应谱，推测获得的表达抗原表位。将对所有患者和染疫动物血清都产生抗体反应的抗原或片段免疫兔，获得相应的抗体。在细胞水平上进行中和试验，获得具有中和活性的抗原。同时对检测患者和染疫动物血清100％阳性的抗原或片段，用双抗原夹心法评价作为诊断抗原的特异性和敏感性。本项目预期将取得2项研究成果：（1）获得具有诊断价值的抗原及其片段；（2）获得具有中和活性的抗原。为可靠诊断技术和疫苗的研究奠定基础。

新疆地区的克里米亚-刚果出血热(CCHF)，又称新疆出血热（XHF），分布广泛，病死率高达50%。研究确定病毒抗原表位，对其诊断和治疗具有重要意义。本研究利用原核表达系统对XHFV S基因和M基因编码的核蛋白(NP) 和 糖蛋白Gp(包括Gn和Gc)进行全长和分段克隆表达纯化，结合改良生物合成肽法和免疫印迹实验，用XHFV单克隆抗体和兔抗重组蛋白多抗对XHFV感染的人及动物血清进行筛查,研究核蛋白和糖蛋白的抗原性，逐级筛选鉴定出保守性和中和性好的优势B细胞抗原表位，并分析S基因和M基因编码蛋白的免疫学特性，较好完成课题规划任务，取得初步研究成果。（1）对NP截短蛋白进行原核表达，利用制备的抗重组NP蛋白的兔多抗和抗天然XHFV的单抗，采用Western blotting、ELISA和蛋白芯片法进行验证，发现XHFV YL04057株NP蛋白的高抗原活性区位于NP的中部区域。采用重叠短肽表达技术获得NP短肽融合蛋白，对NP高抗原活性区进行优势抗原表位筛选，应用Western blotting方法检测验证XHFV阳性血清，筛选出该蛋白抗原3个表位优势区。进一步采用合成多肽的肽扫描方法对优势抗原表位进行鉴定，首次发现XHFV核蛋白上的6个精确B细胞线性抗原表位（BCEs）。序列比对结果显示，精确抗原表位区高度保守。三维立体结构分析，6个BCEs都在NP蛋白的茎部末端外部区域，位于一个灵活的“螺旋-转角-螺旋”结构域上，为进一步了解XHFV核蛋白抗原结构，建立鉴别诊断方法及研制新型疫苗开辟了新途径。（2）利用制备的抗XHFV重组Gn、Gc蛋白的兔多抗，对原核表达的截短糖蛋白进行抗原表位分析，结合Western blotting检测验证XHFV阳性血清，首次发现XHFV 79121株糖蛋白上至少含有6个优势B细胞线性抗原表位，其中之一可能为中和抗原表位区，位于Gc末端区，保守性强，为获得免疫保护抗原靶位，开展疫苗、病毒功能机制等研究提供了可靠工具。（3）通过制备S、M基因和嵌合基因疫苗及重组蛋白疫苗免疫小鼠，分析了其免疫学特性和免疫应答的效果,为进一步研制XHFV基因工程疫苗奠定了基础。