Myosin 7a马达蛋白质大分子复合物体外重建及功能研究

Unconventional myosin 7a constitutes one of main power systems in cell. Deletion or mutations in the myosin 7a gene cause cellular dysfunction, developmental defects, and even lethality. The study of myosin 7a regulation, (the turning on or off of myosin 7a ATPase activity), its macromolecular assembly and translocation will reveal the normal and pathologic mechanisms of myosin 7a-based functions, about which little is presently known. We have successfully screened and identified an important myosin 7a binding partner that is likely to regulate myosin 7a through the binding of the myosin tail domain. Sequence analysis and protein 3D homology modeling of this binding partner suggest that its NH2-terminus may itself bind to Rab, which would recruit membrane sorting and vesicular trafficking to this process. Macromolecular protein complexes based on myosin 7a will be expressed, reconstituted and co-purified from an Sf9-Baculovirus expression system, allowing their study in a cell free system. The ATPase activity and motility properties of wild type and mutant myosin 7a complexes will be analyzed with high-resolution TIRF microscopy at the single-molecular level. The results will add to our understanding of the protein complex structure & function, the process of organ development and the pathologic consequences of myosin 7a mutations at the molecular level.

Myosin 7a马达蛋白质是细胞内主要动力系统之一，该基因缺失或突变将导致细胞功能异常，发育缺陷，甚至生物个体的死亡。基于Myosin 7a大分子复合物的ATP酶活性调节、组装机理和运动模型研究，对于理解其生物学功能和致病机理起着重要作用。我们前期的结果显示Myosin 7a通过分子内折叠抑制其ATP酶活性，并筛选出一个能激活Myosin 7a ATP酶活性的新结合蛋白，蛋白质3D结构同源模拟显示该结合蛋白NH2端与Rab结合，参与膜的分选和运输。本项目利用酵母双杂交和昆虫-杆状病毒表达系统寻找能激活Myosin 7a ATP酶活性的结合蛋白，并在细胞内组装其大分子复合物。利用高分辨率、全内反射荧光显微镜（TIRF）在单分子水平比较Myosin 7a 野生型和突变型大分子复合物的ATP酶活性及运动特性。所形成的结果有助于揭示该蛋白质复合物结构、功能及器官发育机理，破解变异引起的分子机制。

哺乳动物和果蝇基因组都含有一个非传统的肌球蛋白：Myosin 7a 基因。该蛋白质包含一个能水解ATP的马达结构域，5个IQ motif，和一个争议的coiled-coil motif以及一个将两个MyTH4-FERM 结构域分开的保守SH3结构域。我们先前的结果已经证明，Myosin 7a 可以通过尾部折叠的方式来钝活其头部马达区ATPase 酶活性（Yang et al. PNAS 106:4189, 2009），并已经发现一个新的结合蛋白质（M7BP）参与Myosin 7a 的活性调节。本项目中我们进一步揭示了M7BP 通过与Myosin 7a 尾部的MyTH7 结合来调节其活性。体外生化和电镜研究表明M7BP并不能形成二聚体结构，它与Myosin 7a 的解离常数（0.6 µM），它是通过增强Myosin 7a与F-actin的表观亲和常数（KATPase=2 µM），但不改变最大反应速度来激活Myosin 7a的活性。细胞内实验进一步验证了M7BP 激活的Myosin 7a后，不仅仅改变其在细胞中的定位，而且明显改变细胞形态。在激活Myosin 7a S2细胞中，伪足数目明显增多，且Myosin 7a/M7BP以共定位的形式，沿着伪足中F-actin进行双向运动。病原体细胞攻击实验也证明，果蝇血细胞（hemocytes）在受到细菌攻击时，其细胞形态发生很大变化，产生大量类似于伪足的结构，参与病原体的吞噬作用，而Myosin 7a/M7BP则出现这些伪足结构中。以上结果暗示了Myosin 7a/ M7BP 可能在病原体的细胞入侵过程中扮演着重要的作用。根据以上结果，我们成功的建立了一个病原体入侵宿主细胞过程中，actomyosin-pathogen 相互作用的分子模型。Co-IP和质谱分析已晒选出了几个候选非传统myosins。这些重要的结果为我们进一步理解这些非传统myosins的结构与细胞功能奠定了重要的基础。