核桃坚果氧化诱导期的表征及其影响因素研究

The oxidation induction period is the initial stage of lipid oxidation and a key point for controlling the oxidation process. In the previous study on walnut oil oxidation markers (J FOOD SCI, 2018), the applicant detected a certain amount of volatile oxidation products from the oil pressed from the newly harvested nut, indicating that the oxidation induction period has already occurred in the nuts. The oil in nuts is present in the form of oil body, and its oxidation accompanied by a series of physiological and biochemical responses. Finding the rules from these physiological and biochemical changes, as well as clarifying the time range and characteristic markers of the oxidation induction period, is crucial for the early control of lipid oxidation in nuts. In this project, the near-mature walnut nuts which have completed oil accumulation are used as materials. Firstly, a joint analysis method of free radical-volatile oxidation products was established to determine the time range of the oxidation induction period. Secondly, during induction period, the transformations of cellular morphology in nuts were studied, along with the dynamic physiological-biochemical changes. Partial least squares regression method was used to screen the markers of induction period. Finally, a nut simulation system was established to study the effects of oxidants (e.g. unsaturated fatty acids) and antioxidants (e.g. sterols) on induction period, aiming to find key impact components. Results can provide a scientific basis for the early control of nut oxidation.

氧化诱导期是脂质氧化的初始阶段，也是控制氧化进程的关键节点。申请人在前期开展核桃油氧化标志物的研究时（J FOOD SCI，2018），从当年采收并压榨的坚果油中检测出一定量挥发性氧化产物，表明油脂氧化诱导期在坚果仁中就已经启动。与坚果油不同，坚果仁中油脂以油体形式存在，其氧化的发生伴随一系列生理生化响应。从这些生理生化变化中寻找规律，明确氧化诱导期的时间范围和特征标记，对于坚果仁中油脂氧化的提前控制至关重要。本项目以已完成油脂积累的近成熟核桃坚果为材料，首先，建立自由基-挥发性氧化产物联合分析法，确定坚果油脂氧化诱导期的时间范围；其次，研究诱导期坚果在细胞形态学和生理生化层面的动态变化，利用偏最小二乘回归法筛选诱导期的特征标记；最后，建立坚果仁模拟体系，研究不饱和脂肪酸等易氧化组分和甾醇等抗氧化组分对诱导期的影响，找到诱导期的关键影响组分。研究成果可为坚果氧化的提前控制提供科学依据。

我国每年因贮藏不当造成核桃的采后损失高达其总产量的12 %。明确核桃采后的氧化劣变机制，是建立核桃标准化贮藏体系的前提。目前，核桃氧化相关研究多针对温度等外部因素，欠缺对其内部氧化关键进程的了解。为此，我们针对氧化过程中核桃仁细胞内部的形态和理化变化开展研究，取得如下主要成果：① 核桃油体形态呈锯齿状圆形或者椭圆形，平均粒径1569.00 nm，ζ-电位为-51.90 mV。其上分布的油体蛋白种类主要为oleosin及oleosin的异构体，分子量分布15~19 kDa。从核桃油体中共鉴定出320种脂质组分，包含单甘油脂、甘油二酯、甘油三酯、甘油磷脂、脂肪酰、鞘脂6大类。其中，甘油三酯TG(18:2/18:2/18:3)含量最高，而DG(18:2/18:2)和LPA(20:5)分别是含量最高的甘油二酯和甘油磷脂；② 随核仁的发育，核桃仁内油体数量逐渐增加且面积增大；蛋白质组学结果表明与油体合成、贮藏蛋白质合成相关的蛋白质在核桃仁发育过程中显著上调；定位于内质网上的JrOLE14.7基因对油体的形态和大小起关键调控作用；③ 核仁发育过程中，内源性多酚物质主要富集在内种皮中，且含量在成熟期内种皮中达最大值。广靶代谢组学共鉴定出53种与多酚合成相关的代谢物，包含15种原花青素、10种山柰酚苷和21种槲皮素苷；阿魏酸、儿茶酚、绿原酸等一些小分子酚类的含量在核桃干燥过程中伴随氧化褐变的发生而增加。④ 相较采收时间、干燥、贮藏等环节，脱青皮时间对核桃氧化褐变的影响最为明显。核桃采后随着含水率的降低，PPO活性均维持在较低活性水平，而酚类物质含量却呈上升趋势，说明由脂质氧化等因素诱发的非酶促反应对内种皮褐变具有重要影响。○5 对核桃仁中的脂氧合酶进行了分离提纯，确定硫酸铵沉淀浓度范围为25-50%，透析12h后利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换法进一步纯化，纯化倍数为60.83倍，比活性为21.64 U/mg，回收率为64%。电泳结果显示核桃脂氧合酶的分子量约为100kDa。本项目研究结果对于明确核桃油脂氧化的关键进程和特征标记具有重要意义，为核桃等坚果氧化精准调控策略和标准化贮藏体系的制定提供了落脚点。