二酰胺类杀虫剂对害虫和天敌的选择性机理研究

以氟虫酰胺和氯虫酰胺为代表的二酰胺类杀虫剂具有独特的化学结构，新颖的作用方式，高效广谱的生物性能和卓越的环境生态安全性，是具有革命性的新一代杀虫剂。其作用于害虫的鱼尼丁受体（RyR），而对非靶标节肢动物具有良好选择性，从而保护了寄生蜂等天敌和传粉昆虫，特别适合于害虫综合治理（IPM）。本项目选择二化螟和二化螟绒茧蜂这一对重要水稻昆虫作为模型，通过克隆两者RyR基因和构建序列置换突变体，并在HEK-293细胞系表达进行药理学实验，发现二酰胺类杀虫剂在害虫和天敌RyR上不同作用模式和位点，为基于靶标的农药分子设计提供模型和依据，也为特异性杀虫剂的前期开发和高通量筛选提供有效的筛选细胞系。对此类杀虫剂作用机制的进一步研究将有助于我们更深入地了解其作用特性，为新农药的创制和今后杀虫剂抗性问题的研究提供理论和技术支撑。

以氟虫酰胺（flubendiamide）和氯虫酰胺（chloratraniliprole）为代表的二酰胺类杀虫剂具有独特的化学结构，新颖的作用方式，高效广谱的生物性能和卓越的环境生态安全性，是具有革命性的新一代杀虫剂。其作用于害虫的鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR），而对非靶标节肢动物具有良好选择性，从而保护了寄生蜂等天敌和传粉昆虫，特别适合于害虫综合治理。本项目选择二化螟和二化螟绒茧蜂这一对重要水稻昆虫作为模型，从水稻害虫二化螟中克隆得到了15562bp的完整鱼尼丁受体CsRyR的基因序列，其中包含一个15387bp，编码5128个氨基酸的开放阅读框（ORF）。定量PCR结果显示该基因在二化螟的肌肉组织有高丰度表达，符合针对该靶标的杀虫剂导致害虫肌肉剧烈收缩致死的症状。将该受体基因CsRyR连接到pcDNA3的载体后通过脂质体稳定转染到HEK-293细胞系中，获得了稳定表达CsRyR的细胞株。钙离子成像实验表明，该细胞株高效表达二化螟鱼尼丁受体蛋白，能够被低至1 nM的氟虫酰胺和氯虫酰胺激活，适合用于杀虫活性物质的高通量筛选。相关成果已经获得授权专利《二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用》（专利公开号：CN102628049B），并发表SCI论文4篇。此外，还在二化螟优势寄生蜂二化螟绒茧蜂中克隆得到了鱼尼丁受体的全长序列（CcRyR），共编码5121个氨基酸。序列对比显示CsRyR和CcRyR的序列在绝大部分区域高度保守，只有跨膜区CcRyR4490-4700这大概200个氨基酸的序列差异是最大的，有较大片段的缺失和插入。目前已经克隆这部分片段，然后把二化螟CsRyR中的对应序列用寄生蜂的该序列替换，验证是否该区域导致了二酰胺类杀虫剂对靶标害虫和天敌的高度选择性。本项目首次克隆得到我国主要农业害虫的RyR基因序列，并获得可以用于高通量筛选的RyR的离体表达细胞系。另外还发现了二酰胺类杀虫剂在害虫和天敌RyR上不同作用的可能靶标序列，可以为基于靶标的农药分子设计提供模型和依据。对此类杀虫剂作用机制的进一步研究将有助于我们更深入地了解其作用特性，为新农药的创制和今后杀虫剂抗性问题的研究提供理论和技术支撑。