藏红花悬浮细胞中藏红花酸糖基转移酶的功能鉴定及调控机制研究

Saffron is known as the "plants gold". crocins, major chemical components of saffron, have good therapeutic effectiveness such as activating blood and dissolving stasis, anticancer, and antioxidant. At present, crocetin glycosyltransferase gene UGTCs2, the key gene for crocin synthesis, had been documented one case which had been obtained from the stigma of saffron. Wherease crocetin gycosyltransferase gene from saffron cultured cell has not yet been reported. Two putative crocetin glycosyltransferases, termed as UGTCs4 and UGTCs5, had gained from saffron cultured cell which belonged to the same subfaimily members with the crocetin glycosyltransferase UGTCs2 based on phylogenetic tree. To gain insight into the similarities and differences of the two putative crocetin glycosyltransferase on the biological functions and transcriptional regulation , two strategies are going to be adopted to identify the biological functions by using transgenic techonolgy in vivo and enzymic assays in vitro, respectively. The promter-drived expression of GUS and real-time PCR technologies would be applied to study the mechanism of the temporal, spatial expression and the transcriptional regulation responding to different stimuli. Through the implementation of the project, the biological function and the transcriptional regulation of the two putative crocetion glycosyltransferases could be elucidated, providing the technical support in medicine technology of the cultured cell and offering more insight into the necessary foundation of theory and practice for genetic engineering.

藏红花素有"植物黄金"的美誉，其主要成分藏红花素具有活血化瘀、抗癌、抗氧化等功效。目前，其关键合成酶藏红花酸糖基转移酶基因世界上仅有一例报道，是来自藏红花柱头。而藏红花悬浮细胞中藏红花酸糖基转移酶基因的研究尚未见报道。UGTCs4及UGTCs5是我们在藏红花悬浮细胞中发现的两个类藏红花酸糖基转移酶基因，分子进化树分析表明，这两个基因与已知报道的藏红花酸糖基转移酶UGTCs2同属一个亚家族的成员。为全面了解这两个基因的生物学功能及调控机制的异同点，本项目研究拟采用转基因技术、体外酶活鉴定两种功能鉴定方式，明确目的基因产物在体内及体外的生物学功能；拟采用启动子驱动下GUS活性分析及Real-time PCR技术，明确目的基因不同时空的转录模式及对不同生理因素的转录调控机制。通过本项目的实施，不仅能为藏红花悬浮细胞产药研究提供技术支持，而且能为基因工程产藏红花素研究奠定理论依据与实践基础。

藏红花素是藏红花中最重要的活性成份之一，是由藏红花酸单、二糖酯类物质组成，具有抗心肌缺血、抗癌等多种药理作用，而且毒副作用小。藏红花酸糖基转移酶基因是生物合成藏红花素最关键的基因，目前仅有两例藏红花酸糖基转移酶基因的报道，如藏红花中UGTCs2，栀子中的UGT75L6 和UGT94E5，本研究中的UGTCs4和UGTCs5是从藏红花细胞中克隆的，通过分子进化树分析，这两个基因与已知报道的UGTCs2同属一个分枝，暗示了其可能具有糖基化藏红花酸的功能，为进一步了解这两个基因的生物学功能，本研究从体外、体内功能以及转录调控、亚细胞定位等多个方面着手开展。.利用异源原核表达体系，分析这两个糖基转移酶体外功能的异同点。UGTCs4重组蛋白在体外能顺序糖基化藏红花酸生成藏红花素苷3和苷5，而UGTCs5则无此功能；对UGTCs4研究其糖苷酶功能，表明该酶具有能使七叶苷脱糖基形成七叶苷原的作用，并且Zn、Mg离子能明显提高其糖苷酶活性，在棉花中该重组蛋白能有效切割叶片中的挥发物前体苷元类物质，释放大量挥发物，利用Y-型嗅觉仪对多异瓢虫、蚜虫进行挥发物选择性实验分析，表明该挥发物能吸引多异瓢虫，驱避蚜虫；利用real-time PCR技术，分析含有UGTCs4基因的转基因拟南芥植株对ABA、NaCl、SA、JA等诱导因素转录调控研究，发现这UGTCs4基因对上述处理都具有响应，其中对ABA、JA的响应尤为显著。以农杆菌介导的转基因方式将两个与GFP融合形成重组蛋白，转化入拟南芥中，利用激光共聚焦显微镜对其进行亚细胞定位观察,这两个基因均定位在植物的细胞膜上；通过对转基因藏红花细胞进行HPLC分析，表明其藏红花素苷2的成分具有明显增高，揭示了UGTCs4基因在藏红花体内参与藏红花素合成代谢的机理，其首先完成了藏红花素苷5、苷3的形成，而苷2的形成则需其他蛋白的协助。这一结果与栀子中的UGT75L6的功能相同，苷2的形成需要UGT94E5的协助才能完成。该项目的实施不仅为藏红花悬浮细胞生产藏红花素，提供了技术支持，而且为利用挥发物控制棉花蚜虫的育种机理、方法研究方面也提供了良好的思路，具有一定的应用转化前景。