液泡加工酶调控苹果根系细胞死亡与根类分化的分子机理

根系是植物立地之本，苹果新根富含液泡且具有独特的分化类型，探讨液泡加工酶（VPE）在其细胞死亡与分化中的作用，在理论和实践上均有重要价值。本项目选择红富士苹果幼树（砧木为平邑甜茶）和平邑甜茶幼苗，以VPE在细胞死亡中的作用为核心，通过干湿交替和H2O2处理干扰细胞死亡和根类分化进程，定期检测不同根系（延长根、吸收根）VPE活性及其基因（Mhvpe）表达，并通过DNA电泳、TUNEL染色、类Caspase检测及流式细胞分析等技术鉴定细胞死亡形式（程序性死亡或坏死），分析VPE、细胞死亡、根类分化的相关性；同时构建Mhvpe正（反）义和RNAi载体，转入烟草（或拟南芥）和平邑甜茶，获取Mhvpe表达上调、下调或沉默的转基因材料，利用转基因材料进一步分析VPE、细胞死亡、根类分化之间的关系，明确VPE通过调节细胞死亡而控制根类分化的机理，为苹果根系管理及其遗传改良提供深层次依据。

本项目以苹果幼树及其砧木平邑甜茶幼苗为试验材料，通过H2O2、重金属镉和干湿交替等处理，检测延长根和吸收根液泡加工酶（VPE）和类Caspase活性、VPE基因（MhVPE）表达和死亡相关基因表达以及细胞死亡特征等，并通过离体试验分析根系VPE与类Caspase相关性等。结果表明，在正常生长发育过程中，吸收根根系活力、ATP含量、类caspase-3活性、MhVPE和促凋亡基因MhDAD表达水平及细胞凋亡率明显高于延长根，抗凋亡基因MhHSP70、MhBI-1和MhBAG基因表达水平明显低于延长根，并且上述指标在吸收根中的变化比在延长根活跃，在延长根中变化平缓，这与吸收根比延长根代谢旺盛、生命周期短、死亡更新快的特点相符。.不论在吸收根还是延长根，VPE活性、类Caspase活性及细胞凋亡率3者变化动态都基本一样；向根系提取液加入VPE活性抑制剂可抑制类Caspase-1活性，加入Caspase活性抑制剂可抑制VPE活性；在VPE或类Caspase-1测定体系中，不论分别加入Caspase-1底物还是VPE底物，均都可测出VPE和类Caspase-1活性，显示VPE与类Caspase-1具有相似催化活性和功能，它能够以类似Caspase的作用调控根系细胞死亡。不论在氧化、高温还是镉胁迫下，根系VPE和类Caspase活性、细胞凋亡率和MhVPE表达水平的变化规律均一致，外用VPE抑制剂能抑制类Caspase-1活性，延缓根系活力下降和 MhVPE 表达，延迟细胞死亡，进一步说明VPE能够以类似Caspase-1的作用调控细胞死亡，MhVPE基因具有类似促凋亡基因的功能。.构建MhVPE正（反）义及RNAi表达载体，获得了转MhVPE拟南芥。上调表达MhVPE的拟南芥叶片数少于野生型，抽苔、开花和结荚时间明显早于野生型；干旱、高温、过氧化氢和硫酸镉处理后，各类型植株VPE活性及MhVPE表达水平显著增加，细胞活性和ATP含量显著降低，并且这些指标在MhVPE基因表达上调植株中的变化程度显著高于野生型，在相同胁迫时间点，VPE基因缺失突变体vpeko的细胞死亡率最低，MhVPE表达上调植株细胞死亡率最高，进一步说明MhVPE表达促进细胞死亡，具有类似促凋亡基因的功能。.项目执行过程中发表论文15篇，培养博士3名、硕士5名，完成了计划内容和指标，达到了预期目标。