海胆调控脂肪酸代谢microRNA的分离和调控网络研究

In this study, gonads of Dalian purple sea urchin at different developmental stages will be collected as materials. Then small RNA solexa sequencing,transcriptome analysis, microRNAs chip and RACE analysis will be used to separate microRNA genes, search and validate of target genes,whereby identify miRNAs involving in regulating fatty acid metabolism. Furthermore, protein interaction network will be constructed within proteins collected from transcriptome analysis to find proteins and miRNAs relevant to fatty acid metabolism via PPI network. Pull-down technology and RACE specific to miRNA mediated cleaving of targets will be conducted to valid the protein-protein interactions and the targets of miRNAs, then providing solid informations to construction a miRNA-target-PPI network regualting fatty acid metabolism. The results of this study will not only deep the understanding the profile of fatty acid metabolism of sea urchin, but also help investigating on adjusting mechanism of fatty acid metabolism of sea urchin feed in the different culturing and feeding conditions.

本研究以不同发育阶段的大连紫海胆性腺为研究对象，利用小RNA测序和转录组分析技术，分离其性腺microRNA基因，microRNA芯片验证其表达；预测和验证靶基因、进行功能注释，构建调控海胆脂肪酸代谢相关的microRNA-靶基因调控网络；同时利用转录组数据进行蛋白质相互作用分析，筛选通过PPI与脂肪酸代谢相关蛋白，以pull-down技术进行验证，挖掘具有间接调控作用的蛋白和microRNA基因，构建调控大连紫海胆性腺脂肪酸代谢的microRNA-靶基因-PPI网络。本研究的结果不但可以填补海胆脂肪酸代谢机制研究的空白，对于了解海胆如何控制脂肪酸的代谢，以及在不同养殖和饲喂条件下海胆脂肪酸代谢及调控的差异都具有重要的理论价值。

利用solexa测序技术，分析了大连紫海胆不同发育阶段和不同性别性腺的miRNA基因，共获得184个miRNA基因，其中66个为保守miRNAs，118为海胆特异miRNAs。利用统计学方法和定量PCR技术，分析了海胆在雌雄性腺中的表达模式。结果表明47 种 miRNA为雄性特有，51 种 miRNA为雌性特有。在这86 个共表达的miRNA中，有 39 个在雌性性腺中显著下调，28个表达显著上调。然后，对雌雄海胆性腺进行了转录组学分析，共获得130124 个转录本和85753 个unigenes 序列，平均N50达到2633碱基。根据基因注释结果，筛选了751个脂代谢相关基因，其功能涉及21个KEGG pathways。从转录组序列中鉴别除了3种类型的fatty acids front-end desaturase (FADS)和3种类型的 very long fatty acids elongase (ELOVL)基因，它们是PUFA合成的的关键基因。同时，还鉴定出了PKS基因，一个在海藻类和海洋微生物中参与PUFA合成的基因。根据基因功能注释和基因表达结果，构建了一个海胆PUFA合成的路线图。利用大连紫海胆的转录组和miRNA测序数据，构建了调控脂代谢基因的网络。结果表明，在669个脂代谢相关基因中，共有662个脂类物质代谢相关基因被397个海胆miRNA基因调控，构成了9041个调控关系。这些靶基因功能涉及基因转录、脂类物质吸收、运输、合成、去饱和和氧化分解，表明miRNA是脂代谢调控的关键因子。对雌雄海胆性腺中mRNA和miRNA表达进行了统计分析，筛选了差异表达基因。结果显示，与PUFA合成的基因，如 Δ 5 desaturase、Δ 6 desaturase、ELOVL4、ELOVL6和ELOVL7在雌性性腺中表达量低于雄性性腺。而SCD表达模式相反。雄性性腺中desaturase和Δ 6 desaturase 表达量是雌性性腺的1.38 和2.30 倍，而SCD表达量低-2.47倍。这与关于海胆雌雄性腺PUFA含量和种类的差异实验结果是吻合的。基于蛋白质同源性分析方法，构建了大连紫海胆性腺蛋白质相互作用网络并进行了拓扑学参数分析。筛选了与PUFA代谢先关的hub蛋白，表明ELOVL6为关键蛋白。全面完成了资助项目计划书的各项目标任务。