基于微流控芯片的力学因子对成骨细胞钙信号调控机制的研究

Calcium signals play a central role in transduction mechanical signal into cells to modulate downstream a variety of physiological functions. Calcium signal is sensitive to environmental mechanical changes, and the pattern of calcium signal is changing with dynamic mechanical conditions, depend on cell growth and differentiation states, including protein expression and activation. Meanwhile, calcium signaling can respond in different calcium patterns at a same force condition, Our previous studies have demonstrated multiple and diverse patterns of calcium responses induced by fluidic shear stress (Fss) in rat osteoblast-like cells. Besides the homogeneous and synchronous calcium responses, generally with two distinct phrases: (i) an early peak phase and (ii) a following plateau phase, multiple and heterogeneous calcium oscillations with different frequencies also existed. So, in this proposal, we will select primary osteoblast-like cells as major target cells, introduce microfluidic chip to exert Fss stimulations, and control cell space and direction by μCP (mirco-contact printing), to research the mechanism of different calcium patterns induced by Fss, including associated signal pathways and proteins. We will summarize the characteristics of homogeneous calcium responses and heterogeneous calcium oscillations under repetitive stimulations, and developed a modified theoretical model for the hypothesis upon the diversity of Fss-induced calcium activities.

钙信号在细胞力学信号转导过程中起到至关重要的作用，并调控下游各项生理活动。细胞的钙信号对周围机械刺激敏感，钙信号模式随力学条件而变化,受细胞生长分化水平、蛋白表达和活性的影响。在相同力学条件下，钙信号可表现出不同的响应模式，我们在前期研究中发现，相同剪切力条件下乳鼠原代成骨细胞钙信号模式的多样性。首先,大部分细胞钙响应同时同步变化，胞内钙浓度在剪切力作用下先出现一个峰值，然后钙浓度维持一个相对高的水平；此外，相当数量的细胞的钙响应呈现出特异性钙振荡，每个细胞钙振荡频率都不同。因此，本课题选择乳鼠原代成骨细胞作为主要靶细胞，利用微流控芯片构建剪切力刺激系统，软光刻微接触印刷技术控制细胞间距，研究力学因子对细胞钙信号的调控机制，探索剪切力控制下成骨细胞胞内钙响应模式多样性的产生机制及相关信号通路和调控蛋白。本项目将对城固细胞中的钙响应模式进行分类，建立剪切力控制的多模式钙响应理论模型，模拟成骨细胞中各种钙响应曲线。

本项目成功优化微通道中细胞图案化的方法，实现微流控芯片中单细胞精准定位，并结合微流控芯片、负压密封、流体驱动与Labview程序控制构建了一整套可以控制细胞间距、细胞方向、流体剪切力强度、频率、方向的细胞力学仿真芯片系统与研究方法。同时基于全新的研究技术，我们系统研究并定量分析了剪切力诱导的钙信号类型和时空变化规律，总结剪切力参数对钙信号的定量调控，分析钙信号通路、细胞间距、细胞方向等因素对研究剪切力诱导的多模式钙信号的调节作用，并利用理论模拟构建了多模式钙响应形成机制。.首先我们构建微流芯片中的单细胞定位方法，优化微接触印刷μCP的技术，调节印章尺寸、粘连蛋白孵育时间、印章按压时间、F127浓度与钝化时间、细胞接种密度与清洗时间，并结合负压密封方法，实现微流控芯片中单细胞精准定位，找到单细胞图案化的最佳条件与便捷操作方法，为研究细胞空间排布与细胞生物-物理信号耦合关系的提供强有力的芯片化技术支持。同时，进一步完善剪切力芯片程序控制的开发，将流体方向、强度、频率实时控制，实现流体周期性往返刺激，时间精度可达到50ms。.再者，为探索多模式钙响应形成机制，我们记录了不同剪切力强度、频率、与方向作用下的成骨成骨细胞钙响应，并且总结出归纳出不同力学模式引起的钙信号频谱特征。结果显示：钙信号多样性受剪切力强度、细胞密度、细胞分化程度影响。细胞对周期性剪切力更加敏感，细胞方向、细胞间距等细胞二维分布的有序性可以增加细胞钙响应的规律性。.此外，我们利用实时检测胞外无钙、胞外无钙ATP刺激、suramine、apyrase、TG、TRPV4激动剂4αpdd与抑制剂GSK101作用下，剪切力诱导的成骨细胞钙响应。结果表明：钙信号多样性是钙内流和钙库释放协同作用的结果，二者耦合的程度决定钙信号模式是振荡还是均匀钙响应；同时4αpdd诱导的钙振荡与剪切力诱导的非常接近，TRPV4通道是一个重要的调节靶点。理论模型计算的结果也支持钙信号多样性来自钙内流和钙库释放的共同作用。