四氢生物蝶呤合成酶GTPCH1和DHFR的泛素化降解与尼古丁诱导内皮功能紊乱的机制

Endothelial dysfunction is a key pathophysiological step in cigarette smoking-induced vascular diseases. The studies showed that smoking and nicotine impaired endothelium-dependent relaxation. Our preliminary results showed that nicotine decreased the level of tetrahydrobiopterin (BH4), a cofactor of endothelial NO synthase (eNOS). In addition, we found that nicotine induced the ubiquitinations and degradation of GTP cyclohydrolase 1 (GTPCH1) and dihydrofolate reductase (DHFR), two key molecules for the bioavailability of BH4. E3 ligase S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) might play important roles during this process. Thus, the central hypothesis is that nicotine lowers BH4 level, induces eNOS uncoupling and endothelial dysfunction by decreasing the levels of GTPCH1 and DHFR via a mechanism involving ubiquitination-proteasome pathway. We will examine this hypothesis by addressing the following specific aims: 1) To explore the role of BH4 in nicotine-induced endothelial dysfunction. 2) To examine the effects and mechanisms of nicotine on the de novo biosynthetic and salvage pathways of BH4. 3) To define the mechanisms of nicotine-induced GTPCH1 and DHFR ubiquitination. 4) To characterize the role of E3 ligase Skp2 in nicotine instigated endothelial dysfunction. These studies will reveal a novel mechanism by which protein ubiquitinations modify endothelial functions and provide a new therapeutic target for smoking-related vascular diseases.

内皮功能紊乱是吸烟导致血管疾病的关键病理生理环节。吸烟及尼古丁削弱内皮依赖的血管舒张功能。预实验显示：尼古丁显著降低一氧化氮合酶（eNOS）重要辅因子四氢生物蝶呤（BH4）水平。尼古丁诱导BH4生成中两种关键酶GTP环化水解酶1（GTPCH1）和二氢叶酸还原酶（DHFR）泛素化降解，E3泛素连接酶Skp2可能发挥重要作用。我们推测：尼古丁促进GTPCH1和DHFR的泛素化降解，阻断BH4的从头和补救合成通路，导致eNOS脱偶联，而诱导内皮功能紊乱。本课题将围绕这一假说开展工作：1）明确BH4缺乏在尼古丁诱导内皮功能紊乱中的作用；2）阐明尼古丁对BH4从头合成及补救生成通路的影响及其机制；3）解析尼古丁诱导GTPCH1和DHFR泛素化降解的机制；4）探讨E3连接酶Skp2在内皮功能紊乱中的作用。本课题将在基因、蛋白及整体水平阐明泛素化在内皮功能中的新机制，为吸烟导致血管疾病提供新的干预靶点。

以内皮依赖性血管舒张反应受损为特征的内皮功能紊乱是吸烟、糖尿病等导致血管疾病的关键病理生理环节。一氧化氮（NO）是最重要的血管舒张因子。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NO合成中重要的限速酶。作为eNOS重要的辅因子，四氢生物蝶呤（BH4）充足时，eNOS呈现偶联状态，生成NO；当BH4缺乏时，eNOS解偶联，产生活性氧而非NO，引发血管舒张障碍。本项目主要研究了尼古丁及E3泛素连接酶Skp2导致血管内皮功能紊乱的机制以及BH4、NO合成的调控机制。取得的主要成果包括：1）阐明了尼古丁损伤内皮依赖的血管舒张反应机制为尼古丁能诱导内皮细胞BH4合成途径的关键酶GTPCH1及DHFR的泛素化降解，引发eNOS解偶联及NO释放减少；2）尼古丁诱导的血管内皮功能障碍可通过给予天然产物原花青素而得到改善；3）发现了核受体PPARδ及天然产物水苏碱也能通过上调GTPCH1及DHFR的表达，改善血管内皮功能；4）除了损伤血管内皮细胞功能之外，烟草颗粒还能促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移等，可能是吸烟诱发血管疾病的另一重要机制；5）在烟草颗粒、尼古丁这些外源物之外，增塑剂邻苯二甲酸二丁酯（DBP）也能通过氧化应激通路激活血管内皮细胞NLRP3炎症小体，引发血管舒张功能障碍；6）明确了E3泛素连接酶Skp2负调控血管内皮功能的作用及机制。过表达Skp2促进血管内皮细胞增殖、迁移及炎症反应并引发血管舒张障碍。而在Skp2敲除鼠中，血管损伤因子棕榈酸则不能损伤其血管功能。以上结果阐明了尼古丁、Skp2及泛素化修饰在内皮功能损伤中的作用及机制，为吸烟导致血管疾病提供了新的干预靶点。同时，明确了核受体PPARδ是调控血管稳态的另一重要靶点，为增加水果和蔬菜的摄入降低心血管疾病发生提供了分子机制。发表标注该项目学术论文15篇；指导博士后2名、博士生5名、硕士生8名。其中毕业博士生3名、硕士生4名。