真菌疏水蛋白HGFI自组装分子机制的研究

真菌疏水蛋白是丝状真菌分泌的一类小分子量蛋白，能在不同界面自组装成膜并改变所修饰界面的表面性质，已被应用于蛋白纯化标签、生物传感器基底、乳化剂以及组织工程新材料等领域，是一个新兴的生物活性纳米材料分子。然而，对于真菌疏水蛋白的结构、聚合状态、自组装和固定化能力的分子机制了解甚少。本研究拟通过蛋白分子关键部分置换和定点突变技术，将II型疏水蛋白HFBI和I型疏水蛋白HGFI中的关键环(C3-C4环)进行置换，对HGFI C3-C4环上带电荷氨基酸进行点突变替换。经过毕赤酵母表达，将分离纯化的突变疏水蛋白，进行分子结构与性质的表征和分析；掌握关键环对疏水蛋白结构、聚合状态、自组装和固定化方面的影响，同时获得不同等电点的应用范围更广的人工疏水蛋白系列，研究其在不同pH值、离子浓度等条件下在固定化基质表面的吸附能力，最终揭示疏水蛋白自组装机制，为更广泛的应用奠定理论基础。

本项目一方面通过分子生物学手段对I型疏水蛋白HGFI和II型疏水蛋白HFBI的C3-C4环进行了置换，并在毕赤酵母中成功表达。将突变体蛋白进行超滤和高效液相分离纯化后，分别利用水接触角、X-射线光电子能谱、原子力显微镜、圆二色谱及Thioflavin T（Th T）和Congo red（CR）荧光标记技术对突变蛋白的分子结构与性质进行了表征和分析。证实了经过大段环替换以后，突变体蛋白仍保持了疏水蛋白的在两相界面自组装成两性蛋白膜进而改变界面的亲疏水性的性质，I型疏水蛋白rHGFI在空气-水界面自组装过程中伴有大量额外的β-片层结构产生，使得其在圆二色谱中的吸收峰向β折叠区域移动，荧光探针THT吸光值急剧增加以及CR吸收峰出现红移现象，此外通过原子力显微镜观察发现C3-C4环在I型真菌疏水蛋白rHGFI杆状结构形成过程中都起了至关重要的作用。另一方面通过基因点突变技术对真菌疏水蛋白HGFI的氨基酸进行了改造，获得了一系列具有不同等电点的HGFI突变体，并对突变体的乳化，分散，表面修饰等活性进行了检测。最后，为进一步扩展疏水蛋白的应用范围，本实验室构建了四种功能性多肽（TPS、CAG、VEGF、Pediocin）和疏水蛋白HGFI的融合蛋白，并对融合蛋白的性质和生物学功能进行了鉴定，结果表明融合蛋白TPS-HGFI保留了TPS小肽的对内皮祖细胞的特异性吸附活性；融合蛋白CAG-HGFI保留了CAG小肽的固定和吸附内皮化细胞的活性；VEGF-HGFI保留了VEGF促进内皮化细胞HUVEC生长的活性，Pediocin-HGFI保留了片球菌素的抑菌活性，与此同时，这三种融合蛋白同时保留了疏水蛋白HGFI的自组装和表面修饰活性。真菌疏水蛋白与TPS、CAG、VEGF的融合在人造血管和再生医学方面有很大的应用潜力，HGFI与Pediocin的融合为疏水蛋白在抗菌材料方面的应用奠定了基础。融合蛋白的这种一种蛋白兼具两种蛋白活性的优势，能极大地拓展真菌疏水蛋白的应用。