利用乳酸乳球菌Nisin翻译后修饰系统对抗癌生物活性多肽的修饰及稳定性的研究

乳酸链球菌素（Nisin）成熟体是由前体Nisin经过包括NisB、NisC、NisT等在内的翻译后修饰系统修饰而成。它形成的五个包括特殊氨基酸在内的硫醚环，对一些蛋白酶产生惰性。因此，多肽分子经此系统修饰后，其稳定性显著增强。细胞凋亡是癌症治疗的研究热点之一，目前发现的一些多肽分子具有促癌细胞凋亡或抑制癌细胞扩散的功能，但这些活性多肽普遍具有体内稳定性差的缺点。本研究以前列腺癌抑制活性多肽为研究对象，利用Nisin翻译后修饰系统进行体内和体外的修饰，在保证生物活性的基础上，提高其稳定性。同时，结合前期发现的对Nisin生物合成系统具有调控作用的新基因feuD的表达, 提高修饰多肽的产量。探讨Nisin生物合成系统对抗癌多肽分子修饰的作用机制，完善该修饰系统对异源多肽分子修饰作用的理论体系。

本研究旨在利用Nisin相关基因簇的生物合成及翻译后修饰系统-简称Nisin修饰系统对外源的生物活性多肽进行酶法修饰，达到稳定多肽分子的目的。项目组首先构建了只表达外源融合多肽的单载体系统，把携带Nisin信号肽和外源多肽的融合编码序列重组质粒转化到具有完整Nisin修饰系统的宿主菌株Lactococcus lactis N8中表达和修饰外源多肽。此过程中，发现Nisin基因簇沉默现象，为了对该现象进行解析，项目组人工设计了十多条融合序列并克隆转化宿主菌，初步掌握了启动子、宿主菌背景等要素对沉默现象的影响。阐明Nisin基因簇沉默机制，将使Nisin修饰系统的作用机制得到更深入的认知。根据Nisin的自我调控和NisB，NisC，NisT的的启动子调控模式，可以推断单载体系统中参与Nisin修饰的酶（NisBTC）不能得到表达，因此，在构建的这种重组菌中融合肽不能得到有效的表达和修饰。鉴于单载体系统存在的问题，为了使融合肽与修饰酶之间在数量上达到平衡以及排除宿主菌背景的干扰，项目组构建了以不含Nisin修饰系统的菌株Lactococcus lactis NZ9000作为宿主的双载体系统。在此系统中，一个载体能够编码NisBTC等Nisin修饰、转运酶，另一个质粒编码融合外源多肽。当在一株Lactococcus lactis NZ9000中同时导入携带融合肽片段的载体和编码NisBTC的载体时，重组菌株就可以完成底物和修饰酶的表达以及酶对底物的修饰作用。项目组利用双载体系统成功表达了修饰酶NisB，但与之共转录的编码NisC和NisT的基因并未获得理想表达，外源融合肽的稳定修饰有待进一步完善。另外，项目组还完成了Nisin前导肽改造，定位于Nisin基因簇的NisP蛋白晶体结构及功能分析，Nisin免疫耐受新机制和外源活性多肽在乳酸菌中的食品级表达等多项关联研究。这些研究成果的取得，为更深入阐明Nisin翻译后修饰系统多肽或蛋白的修饰、剪切、表达调控机理和基因沉默提供了更加详实的科学依据。发表期刊论文5 篇，其中SCI 论文 3篇；国际会议论文3篇，国内会议论文2篇；撰写中 SCI 论文3 篇；申请发明专利1项；培养博士毕业生 2名，硕士生毕业生3 名。达到了申请书中的目标要求。