基于食管3D类器官模型探讨炎症微环境下NOTCH信号通路失活对食管上皮稳态的作用机制

NOTCH1 is known as a driver suppressor gene in esophageal cancer. Our previous study found that NOTCH1 gene loss occurred predominantly in esophageal cancer, precancerous lesion and health esophageal tissues. NOTCH1 mutated subclones could be accelerated by alcohol consumption and smoking and increased their number and size with ageing. We presume that NOTCH1 loss is necessary but non-sufficient conditions for esophageal carcinogenesis, and exposures such as injury and pathogen infection would drive subclones with NOTCH1 loss. In this proposal, we will 1) mimic the micro environment under injury and pathogen infection condition, establish 3D esophageal organoid with NOTCH1 loss; 2) determine the proliferation-differentiation characteristics of NOTCH1 loss cell in cultured esophageal organoid model, and pinpoint the key proinflammatory factors driving NOTCH1 mutated subclones towards proliferation; 3) Compared the major pathway alternation between NOTCH1 normal and loss organoid in context of specific inflammatory environment by transcriptome and metabolism analysis, argue that NOTCH1 gene loss and inflammatory environment could react together to disrupt the esophageal epithelium hemostasis. This study may enable us to understand the process of tumor cell growth and will provide new insight into the esophageal cancer prevention and therapy.

我们在前期的食管癌基因组分析中，发现NOTCH1基因失活变异，在食管癌、癌前病变和正常食管细胞中普遍存在。有研究发现NOTCH1基因变异在健康人群中随年龄增长，且吸烟及饮酒与其突变频率增加相关。我们推测NOTCH1失活是食管癌发生的必要非充分条件，而外界暴露因素可能对其克隆扩张起到推动作用。本研究拟在此基础上，1）模拟损伤和病原感染的食管微环境，建立NOTCH1突变食管类器官模型；2）通过对NOTCH1突变细胞在类器官模型中增殖、分化等生长特征分析，明确促进NOTCH1突变细胞增殖的关键促炎性因子；3）对炎性微环境下生长的类器官模型进行全转录组和代谢组分析，论证NOTCH1突变细胞在特定微环境下破坏食管上皮稳态的作用机制。本研究提出了一种新的食管癌前病变的发生假说，将有助于我们理解肿瘤的细胞生物学生长过程，为食管癌前病变研究提供更多的分子生物学证据，从而为食管癌的预防和治疗提供新的思路。

NOTCH1基因突变不仅在食管癌中高频发生，现有研究证据还发现其驱动突变亚克隆在正常食管上皮中发生了正选择进化，提示NOTCH1缺陷与食管上皮细胞的癌化密切相关。在项目资助期间，我们首先收集临床样本，建立了成熟的食管上皮组织类器官模型培养体系，并成功构建了食管上皮组织类器官模型。同时，我们通过CRISPR-CAS9技术并采用HDR同源修复方法，构建了含有GFP示踪标记的NOTCH1缺陷体外模型HEEC-GFP-KI-NOTCH1-KO。我们还收集了TCGA数据库中92例食管鳞癌的外显子组和转录组数据，分析了NOTCH1基因在突变状态下和不同 mRNA表达水平下，差异基因的表达和聚类情况，以探讨NOTCH1基因变异对食管癌细胞生物学功能的影响。其次，我们通过CO-IP实验和MS质谱进行蛋白组测序，对食管癌细胞系和正常食管上皮细胞系中与NOTCH1蛋白发生相互作用的蛋白进行分析，评估NOCTH1在癌和正常组织中参与的蛋白互作网络的差异。我们还通过转录组测序，研究NOTCH1缺陷条件下基因表达的差异情况。研究结果表明，NOTCH1参与的细胞生物过程在正常食管和食管癌中是高度一致的，在RNA代谢和细胞压力反应过程中发挥重要作用。食管上皮细胞暴露于化学物质、高温、损伤、病毒感染等压力下，一旦NOTCH1基因发生缺陷，将影响食管上皮细胞形成对压力的保护反应，从而促进肿瘤的发生。NOTCH1突变状态的食管鳞癌样本，细胞内转录谱表现为固有免疫反应激活、NFKB和IL-17等炎性信号通路激活的状态，也证明NOTCH1突变的肿瘤克隆在炎性肿瘤微环境下适应性生存。NOTCH1基因缺陷模型中高表达促炎因子IL1A、IL6、IL20、IL24、趋化因子CXCL2，低表达III型干扰素(IFNL1, IFNL2, IFNL3)，从而进一步重塑食管癌肿瘤微环境，促进正常上皮细胞的癌化。本研究通过构建NOTCH1缺陷的食管上皮细胞模型，集合转录组、蛋白组、免疫共沉淀，以及生物信息学分析手段，发现NOTCH1基因缺陷促进细胞炎性微环境的形成，并影响食管上皮细胞对压力的反应，从而促进正常上皮细胞的癌化，为食管癌发生的机制提供了重要的分子机制线索。同时，我们还在本课题的资助下，建立了食管癌类器官构建技术，并将其拓展应用于肿瘤患者的药物敏感性筛选，有望转化为临床新技术的应用。