amiRNAs纳米化诱导植物病毒病广谱抗性及其分子机理研究

黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus,CMV）是危害作物最严重的世界性病害之一，其2b基因因序列变异呈现功能多样化和互补性,是改良作物对CMV抗性的理想靶标。本研究2b基因两个α螺旋间区和不同保守程度序列为靶标，以适合不同环境表达的miRNA319前体为骨架，构建amiRNA319并分别导入双T7启动子原核载体和双2×35S启动子植物表达载体，用纳米材料传递DNA或体外转录获得的dsRNAs进入植物细胞诱导抗性，结合离体和活体条件以及农杆菌侵润法，研究比较不同amiRNA319介导CMV的抗性和抗性谱，通过分析建立一套amiRNAs介导病毒抗性的预测体系。同时用amiRNA319遗传转化烟草，用人工摩擦接种和昆虫介体传毒研究转基因烟草的抗性、抗性谱，并比较不同温度条件下抗性稳定性差异，利用嫁接研究抗性信号转导，并对分子机理展开研究，为CMV的防治提供新策略和理论基础。

黄瓜花叶病毒目前缺乏有效的防控措施。项目基于多功能蛋白2b 基因，不同株系间序列变异能突破植物免疫系统，是改良作物对CMV 抗性的理想靶标。结合研究基础，以2b 基因不同保守程度序列为靶标，以miRNA319 前体为骨架，构建amiRNA319 并分别导入双T7 启动子原核载体和双2×35S 启动子植物表达载体，用纳米材料载体传递DNA或体外转录获得的dsRNAs，结合离体和活体条件以及农杆菌侵润法，比较不同amiRNA319 介导CMV 的抗性和抗性谱，分析建立一套amiRNAs 介导病毒抗性的预测体系；人工摩擦接种和昆虫介体传毒研究转基因烟草的抗性、抗性谱，并比较不同温度条件下抗性稳定性差异，利用嫁接研究抗性信号转导和分子机理。结果表明：1、成功地构建了amiRNAs 介导病毒抗性的预测体系，其预测模型为Y=-1.186X+4.075（R=0.963），可以用于amiRNAs和dsRNAs介导病毒抗性的预测和分析；其抗性和抗性谱的顺序为CMV-MIRNA-2b-3> CMV-MIRNA-2b-6>CMV-MIRNA-2b-2>CMV-MIRNA-2b-4>CMV-MIRNA-2b-1>CMV-MIRNA-2b-5，而且不同温度条件下以CMV-MIRNA-2b-3、CMV-MIRNA-2b-6和CMV-MIRNA-2b-2诱导抗性比较稳定；2、CMV-MIRNA-2b-3转基因烟草对不同亚组CMV株系具有抗性且基本上为高抗到免疫，蚜虫攻毒表明CMV-MIRNA-2b-3的抗性均为免疫;而CMV-MIRNA-2b-6和CMV-MIRNA-2b-2转基因烟草对CMV亚组I株系均具有抗性，但是对CMV亚组II株系的抗性存在变异，可能由于起始信号的强弱不同所致；3、不同温度条件下，不同构建转基因植株的抗性存在差异，其中CMV-MIRNA-2b-3对CMV所有株系在20℃;25℃;30℃是均具有很好抗性，免疫植株达90%，而在15℃时抗性存在变异，免疫为68%；其他不同同源性转基因植株在15℃和20℃时存在不同程度的抗性突破，证明随机序列amiRNAs介导的抗性在低温条件下存在抗性突破风险，作物改良过程中应引起重视；4、通过嫁接证明amiRNAs介导的抗性信号分子siRNAs主要向上传递，并在细胞间信号传递以维持抗性。以上研究有望为抗CMV种质资源创制和防治提供新策略。