乳杆菌素LB-B1抑菌机理及其结构基因鉴定的研究

目前，细菌素作为一种安全高效的天然生物防腐剂，在乳肉等食品保藏中的应用受到了极大的关注。国内对于细菌素的研究主要集中在细菌素的筛选、生化性质分析，而对细菌素抑菌机制及生物合成途径的研究尚未见报道。本项目拟以分离自新疆酸马奶中乳杆菌所产的耐酸耐碱乳杆菌素LB-B1为研究对象，对其理化特性（包括酶、酸碱、热的稳定性及抑菌谱）、分子量及其N端的氨基酸序列进行分析；并从形态、生理生化、亚细胞结构变化的角度研究其抑制单核细胞增生李斯特氏菌的作用机制；进而通过分子生物学方法对该细菌素基因簇进行遗传定位并预测结构基因，利用同源重组单交换定点突变并结合超量表达互补实验确定此细菌素的结构基因。本研究将为阐明具有自主知识产权的乳杆菌素LB-B1的生物合成途径奠定理论基础，且为其在乳、肉等食品中的应用提供科学依据。

随着生活水平的提高，食品防腐剂的安全性问题日益受到人们的关注。乳酸菌细菌素是一种天然的食品防腐剂，因具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点而受到了极大的重视。本论文对从新疆酸马奶中筛选的植物乳杆菌LB-B1所产的细菌素进行系统研究，实验结果为该细菌素在食品中的应用提供理论依据，研究内容如下：（1）新疆酸马奶中产细菌素菌株的筛选和鉴定：从新疆地区收集的10份酸马奶中分离出64株乳酸菌，其中一株乳杆菌对单核细胞增生李斯特氏菌54002具有较强的抑 菌活性。经排除有机酸、过氧化氢等干扰后，确定该抑菌物质为细菌素。菌株经16S rRNA分子水平鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LB-B1。.（2）确定植物乳杆菌LB-B1产细菌素的最佳培养条件为：37℃静置培养14h，培养基初始pH值为7。培养基成分为：葡萄糖30g/L、胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-80 4mL/L。优化后，植物乳杆菌素LB-B1产量达10240AU/ml，提高了3倍。.（3）植物乳杆菌素LB-B1理化性质确定：植物乳杆菌素LB-B1具有良好的酸碱稳定性（pH2~10）和热稳定性（121℃，15min）。以单增李斯特菌54002为指示菌，测得该细菌素的作用方式为杀死细菌但不裂解细胞。该细菌素抑菌谱较广且对敏感菌株和拮抗菌株都有吸附性。利用透析实验结合Tricine-SDS-PAGE分析测得植物乳杆菌素LB-B1的分子量在3.5~6.2kDa之间。.（4）植物乳杆菌素LB-B1的基因簇结构分析：根据目前发表的植物乳杆菌素的基因簇序列，设计7对保守引物。以植物乳杆菌LB-B1基因组为模板，利用PCR技术进行扩增。结果表明：植物乳杆菌素LB-B1的基因簇与片球菌素PA-1/AcH的同源性达到99%。并进一步对植物乳杆菌LB-B1中的质粒进行了鉴定。.（5）敏感菌株植物乳杆菌WQ0815中ElltMan的IID功能鉴定：采用同源重组技术，将对植物乳杆菌素LB-B1敏感的植物乳杆菌WQ0815中的IID进行突变，突变株对植物乳杆菌素LB-B1产生抗性，说明敏感菌株中ElltMan的IID是植物乳杆菌素LB-B1发挥抑菌作用时的结合位点。