外泌体介导的LncRNA Linc00881胞间转移通过影响肺成纤维细胞功能促进骨肉瘤靶向转移的机制研究

The lung is the most common target organ of osteosarcoma metastasis. However, the lung-targeting mechanism of osteosarcoma metastasis is still unclear. Our pre-experiment found that the osteosarcoma exosomes treatment of lung fibroblasts can promote the invasion of osteosarcoma cells. And the transcriptome analysis of osteosarcoma exosomes and exosomes-treated fibroblasts showed that a lincRNA Linc00881 was one of the main factors that may be delivered into the lung fibroblasts by osteosarcoma exosomes. Bioinformatics analysis combined with the results of pre experiment both suggested that Linc00881 could promote the secretion of MMP2 in lung fibroblasts through the ceRNA mechanism, which could help the invasion and metastasis of osteosarcoma. Using the reporter gene system, FISH, RIP, and CRISPR-Cas9 technology in the mice, cell lines, and clinical samples of osteosarcoma, this project aims to further investigate the role of exosomes on lung fibroblasts regulation in the osteosarcoma with lung metastasis, and to find the key regulatory molecules of osteosarcoma pulmonary metastasis. These findings may be valuable for the early diagnosis and targeted therapy studies of osteosarcoma pulmonary metastasis and may provide novel research targets with potential clinical translational medicine value.

肺部是骨肉瘤最常见的转移靶向器官，但目前对骨肉瘤肺转移的靶向机制尚不清楚，缺乏有效的早期诊断指标。本课题组预实验发现，骨肉瘤外泌体（exosome）处理的肺成纤维细胞可以促进骨肉瘤细胞侵袭能力，并通过 exosomes处理的成纤维细胞和骨肉瘤exosomes的转录组聚类分析，初步筛选到Linc00881可能被exosomes递送到肺成纤维细胞的主要因子之一。生物信息学分析结合预实验结果提示Linc00881可能通过ceRNA机制促进肺成纤维细胞分泌MMP2，从而协助骨肉瘤发生侵袭和肺转移。本项目拟进一步运用报告基因系统，FISH，RIP，CRISPR-Cas9等技术在小鼠、细胞系、临床样本中系统研究骨肉瘤exosomes对肺成纤维细胞的影响及其在骨肉瘤肺转移中的作用机制，旨在找到影响骨肉瘤肺转移过程的关键分子和通路，从而为骨肉瘤肺转移的早期诊断和靶向治疗提供具有潜在临床转化价值的研究靶点。

骨肉瘤是临床最为常见的恶性骨肿瘤,具有肺部靶向转移的特性，其早期肺转移严重影响患者预后，然而骨肉瘤的靶向性肺部转移的原因仍不清楚。非编码RNA占据人类基因组的70%， 在生命过程中发挥重要调控作用。已证明lncRNA、mirco RNA在骨肉瘤发生发展中发挥重要的调控作用，但是其具体机制尚未完全阐明。外泌体是细胞释放的一种纳米双层脂质膜囊泡，其中的多种成分可以转移进入其他细胞发挥作用，但外泌体在骨肉瘤肺部转移过程是否发挥作用尚未完全研究。针对该问题，我们前期预实验发现被骨肉瘤外泌体预处理后的肺成纤维细胞可以促进骨肉瘤侵袭能力。这提示骨肉瘤外泌体可以在转移前改变影响靶向部位的微环境细胞，从而适宜骨肉瘤细胞的后期转移与定植。我们通过qPCR、western blot、CCK8、transwell、双荧光素酶报告基因实验等一系列检测方法，对骨肉瘤发生发展过程中的功能变化和调控机制进行研究，得出结论如下: 1.骨肉瘤细胞分泌Linc 00881作用于肺成纤维细胞促进骨肉瘤肺转移，且Linc 00881在骨肉瘤中高表达，并促进骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭，且这一作用是通过与与miR-29结合，通过ce-RNA机制上调MMP2表达实现的。同时Linc 00881促进体内骨肉瘤发生。2.骨肉瘤细胞低表达miR-422a，miR-422a通过上调靶基因BCL2L2和KRAS蛋白表达减少，实现低表达miR-422a抑制骨肉瘤发生发展的功能。3.骨肉瘤中高表达lncRNA-AWPPH，通过lncRNA-AWPPH/PI3K/AKT信号通路促进骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭，并抑制骨肉瘤细胞凋亡；4.骨肉瘤细胞中高表达miR-17，通过靶向结合SASH1的3’-UTR，抑制SASH1表达，促进骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭，并抑制骨肉瘤细胞凋亡。通过这些研究，我们发现了骨肉瘤发生发展相关ncRNA，有望成为骨肉瘤早期诊断、预后评价指标，为骨肉瘤转移的诊断、治疗及预后提出新思路。