外泌体介导miRNA-194在骨肉瘤肺转移中的作用及机制研究

Osteosarcoma (OS) always leads to poor therapeutic effects mainly attributed by pulmonary metastasis. Exosomes were found that they could mediate regulation of cancer metastatic process, show affinity to specific target organs and alter the microenvironment，which may be one of the important mechanism of tumor metastasis. By multiple RNA sequencing, we have successfully selected and verified miRNA-194 playing important roles in OS metastatic process；by experiments in vitro and in vivo, we found miRNA-194 regulated metastasis of osteosarcoma by downregulating CDH2 which was the key target gene of EMT of tumor；we also found abnormal expression of miRNA-194 in exosomes by exosome separation and multiple RNA sequencing between two OS cell lines with different metastatic potentials. So we hypothesize that: exosomes could transport miRNA-194 regulating metastasis of osteosarcoma by effecting on target genes. Based on our former studies, we will proceed several experiments in vitro and in vivo to find the effects and mechanism of exosome-dependent miRNA-194 regulating pulmonary metastasis of osteosarcoma, and verify the feasibility of the exosome-dependent miRNA-194 as the prognostic marker for pre-metastatic stage. Our project will contribute to understanding the molecular mechanism of OS metastasis and offering the theoretical basis and technical possibility for miRNAs served as biomarkers for early diagnosis and therapeutic intervention.

肺转移是导致骨肉瘤总体治疗效果不佳的主要原因。新近研究发现外泌体在肿瘤转移中发挥重要介导传递作用，且与转移的亲器官属性和微环境的改变密切相关，可能是肿瘤转移的重要机制之一。我们前期利用基因芯片对不同转移潜能骨肉瘤细胞进行分析，确定miRNA-194与转移密切相关；体内外实验证实miRNA-194通过靶向作用CDH2等肿瘤EMT过程关键靶基因调控骨肉瘤的转移；对不同转移潜能骨肉瘤细胞外泌体进行分离和高通量测序，同样发现miRNA-194表达异常。据此我们提出：骨肉瘤细胞外泌体介导miRNA-194，通过调控相应靶基因参与肺转移的科学假说。本课题拟在前期研究的基础上，通过体内外实验，进一步明确外泌体介导miRNA-194参与骨肉瘤肺转移的分子机制，并结合动物及临床样本验证外泌体中miRNA-194用于骨肉瘤早期转移的诊断机制。通过本项目研究，为阐明骨肉瘤转移的机制及寻找分子标记物提供科学依据。

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤之一。具有转移，尤其是肺转移的高风险，伴肺转移患者的5年生存率不到30％。目前尚无有效的骨肉瘤转移生物标志物。细胞外囊泡（EV）作为新发现的细胞间通讯媒介，能携带microRNA（miRNA）并在细胞间稳定传递；且携带miRNA的EV可存在于循环系统中，因此血浆EVs中包含的miRNA可能会是骨肉瘤的理想生物循环标志物。这项研究的目的是证实骨肉瘤中的潜在抑癌基因miR-101，并探讨EV介导的miR-101在体内抑制骨肉瘤转移的潜力以及血浆EVs内miR-101（EV-miR-101）在临床骨肉瘤转移预测中的潜在价值。. 通过原位杂交（ISH）研究骨肉瘤标本中miR-101与骨肉瘤进展的关系，并在体内模型中研究miR-101的潜在抑制作用。使用软件分析，荧光实时定量PCR，western blot和双重荧光素酶报告基因测定探索miR-101在骨肉瘤中的作用机制。通过慢病毒转导脂肪间充质干细胞（AD-MSC），以获得富含miR-101的EVs。Transwell法和骨肉瘤的肺转移模型观察高表达miR-101的EVs对骨肉瘤转移的作用。通过qRT-PCR在骨肉瘤患者和健康对照患者中检测血浆EV-miR-101水平。. 结果显示：与非转移性临床标本相比，转移性骨肉瘤标本中的miR-101表达明显降低。体内外实验证实，miR-101在骨肉瘤中发挥明显的抑癌作用。发现BCL6为miR-101的直接靶基因。通过慢病毒转染，成功利用AD-MSC得到高表达miR-101的EVs，并被发现在体外对骨肉瘤细胞的侵袭和迁移发挥抑制作用。其系统注射能有效抑制体内肺转移，且无明显副作用。最后，我们发现骨肉瘤患者的EV-miR-101水平低于健康对照者，而发生转移者的EV-miR-101水平低于无转移者。血浆EV-miR-101可用于骨肉瘤病人的诊断和预测。. 我们发现，在骨肉瘤中，miR-101通过下调BCL6来发挥其抑癌作用。AD-MSC来源的富含miR-101的EVs在转移性骨肉瘤治疗中提供了一个潜在创新思路。EV-miR-101也有望成为骨肉瘤转移诊治的循环生物标志物。