多生长因子对骨组织再生调控机制探索及基于超临界流体技术的骨修复系统构建

组织工程骨的形成、发育及修复的过程中，各种生长因子对局部组织、细胞的调控至关重要，分别作用于不同时相，且存在相互协调作用。本项目在采用模糊数学灰色系统关联度法分析不同生长因子对骨组织细胞代谢、新血管生成及新骨基质合成的显著性及协同效应并探索其作用机理，建立促进新骨生长及血管化的多生长因子释放优选模型的基础上，采用超临界流体技术将不同生长因子载入多孔复合载体中，设计并构建具有持久可控释放的多种生长因子控释系统。探索超临界流体制备多生长因子缓释系统的释放特性及调控方法、超临界流体过程生长因子稳定性、体外生物活性功能评价及生长因子缓释系统在体内对骨再生修复治疗的效能评价，以及不同生长因子调控骨再生修复的差异性及相关机理等，为探索骨再生修复的有效途径奠定理论和实验基础。

本项目旨在研究多种生长因子对新骨基质合成和新血管生成进行调控的显著性及协同效应并探索其作用机理，构建通过多种生长因子可控时序释放而具有组织诱导和血管生长诱导效应的组织工程修复体。首先通过功能对比筛选出对骨组织再生修复调控作用最为显著的BMP-2(骨形态发生蛋白-2)、VEGF(血管内皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)等生长因子，考察细胞活力、碱性磷酸酶微量蛋白、矿化形成的钙结节、成骨分化标志性蛋白骨钙素及I型胶原的表达，系统研究了多生长因子协同作用对成骨细胞及骨髓间充质干细胞增殖、分化与成骨矿化的调控作用。结果表明三种因子共同作用时在较低浓度(分别为50、1 和10 ng/mL)已显示出明显的促进作用，且在BMSCs增殖期(前7天)应用VEGF和bFGF，分化期(后7天)应用BMP-2，能够显著促进BMSCs的成骨分化，表现出显著的协同效应并显现剂量依赖和时间依赖。同时，通过检测体外培养HUVECs的血管分化和鸡胚绒毛尿囊膜中血管的生成证实三种生长因子协同作用对血管内皮细胞增殖及血管化具有协同促进效应。基于新骨基质合成及新血管生成对三种生长因子协同作用的时间依赖性、剂量依赖性，确定了促进新骨生长及血管化的生长因子释放优选模型。在此基础上，以不同PLLA分子量、PEG分子量和PEG加入量组合为基质材料，采用复乳液法分别制备具有不同释放行为的三种关键生长因子缓释微球，突释期释放分别为5.63、8.22和7.71 %，21天后累计释放率分别达到87.06、93.24和91.65 %，符合药物缓释微球的一般规律。按照设计释放剂量将三种生长因子缓释微球与HA/PLGA复合微粒共混，经模压预成型后采用超临界二氧化碳发泡形成载生长因子缓释微球的PLGA多孔支架，孔隙呈三维网状结构，孔径100-300 µm，孔隙率为74.46 ± 0.48 %，抗压强度为7.91 ± 0.32 MPa。复合支架能够持续释放三种生长因子并实现生长因子的可控时序释放。体内外试验表明，所构建的载生长因子的复合修复体对BMSCs增殖、分化、成骨矿化以及血管生成具有良好的促进效应，研究结果为新型骨组织工程修复体的研究开发提供了理论基础和实验依据。