HMGB1调节血管内皮细胞屏障通透性及肝素保护作用的机制研究

In previous studies supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30901438), to investigate the effects of the overexpression or silencing of HMGB1 gene on the activation of human endothelial cells, we established the vascular endothelial cell strains with the stable expression or knockout of HMGB1 gene. In conclusion, we demonstrated that HMGB1 affected the expression of E-selectin via HOXA9 in human umbilical vein endothelial cells and mediated the leucocyte transendothelial migration. Furthermore, we characterized the role of HMGB1 in endothelial cell cytoskeletal rearrangement and vascular permeability. However, the molecular mechanisms by which HMGB1 contributes to endothelial cell cytoskeletal rearrangement and barrier dysfunction remain poorly characterized. Therefore, the purpose of this study is to investigate the potential for HMGB1 to play a role in actin cytoskeleton rearrangement, tight junction (TJ) protein disassembly, and an increase in vascular barrier permeability in human pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs). In addition, Our study uses primary PMVECs as an in vitro vascular barrier model to establish whether p38/NF-κB or Rho/ROCK signaling pathway plays a role in the process of TJ disassembly, stress fiber formation, and increasing vascular barrier permeability by HMGB1. Since HMGB1 also exhibits heparin-binding activity, we investigate whether unfractionated heparin interferes with HMGB1 and HMGB1 receptors interaction. Furthermore, we investigate the effect of unfractionated heparin on the conformation of HMGB1 and the mechanism of unfractionated heparin restraining HMGB1-induced inflammatory events and vascular barrier disruption. In a word, this study thus contributes further to elucidating the molecular mechanism of increasing the permeability of the microvascular endothelial barrier by HMGB1 and provides a theoretical basis for clinical application of unfractionated heparin.

在前项国家青年科学基金项目资助下，我们建立了稳定表达或"敲除"HMGB1基因的内皮细胞株，从"沉默"HMGB1表达的细胞中筛选出差异表达的HOXA9。初步研究表明：在内皮细胞中，HMGB1通过HOXA9调节E-选择素表达，介导粒细胞跨内皮迁移并增加内皮细胞通透性。但关于HMGB1诱导内皮细胞骨架重排和开放紧密连接的机制，目前仍不清楚。为此，本项目首先研究HMGB1对内皮细胞骨架与紧密连接结构和功能的影响，明确HMGB1对内皮细胞骨架和紧密连接的调节效果；进一步研究HMGB1是否通过p38/NF-κB通路和/或Rho/ROCK通路介导细胞骨架重排和调节紧密连接功能；明确HMGB1调节内皮细胞骨架和紧密连接的可能机制；在此基础上，研究肝素与HMGB1结合后，HMGB1构象及其与受体亲和力的变化，以及对细胞骨架形态和紧密连接功能的影响；探讨肝素调节HMGB1活性及改善内皮细胞屏障通透性的机制。

血管内皮细胞在维持微循环完整性方面发挥着重要作用。脓毒症时，细胞因子和炎症介质可诱导内皮细胞形态学改变。内皮细胞紧密连接和黏附连接的破坏可增加血管内皮通透性，在感染性休克和急性肺损伤的病理生理过程中发挥重要的作用。紧密连接由跨膜蛋白（包括Occludin、Claudin和ZO-1等）形成的细胞间密封结构构成；黏附连接由血管内皮钙粘蛋白和beta-连环蛋白构成。紧密连接和黏附连接在维持内皮细胞屏障功能方面发挥重要的作用。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种重要的核染色质蛋白，可与DNA结合发挥转录调节作用。在炎症反应过程中，细胞外HMGB1可由免疫细胞分泌，包括巨嗜细胞、单核细胞、树突状细胞等等。HMGB1作为一种炎症介质可以进一步促进更多的促炎介质（如TNF-α和白介素--1, 6, 8等）释放。研究表明在关节炎、局部缺血、结肠炎和脓毒症时，通过中和抗体中和HMGB1活性后，可以减轻组织的炎症损伤。.我们前期研究表明下调HMGB1表达可以减轻急性肺损伤的严重程度；研究表明，急性肺损伤时血管内皮细胞紧密连接和黏附连接的破坏可以增加血管内皮屏障通透性。然而，HMGB1诱导内皮屏障通透性增加的分子机制，目前仍不清楚。普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一种广泛应用的抗凝药物，UFH还具有广泛的保护作用，包括抑制炎症反应、抑制细胞凋亡和改善微血管内皮屏障通透性等。研究表明UFH通过阻断HMGB1与巨噬细胞表面受体的结合而抑制HMGB1诱导的炎症反应。近来研究表明UFH可以通过改变HMGB1的构象而降低其与受体的亲和力。目前，我们研究UFH抑制HMGB1诱导的血管内皮通透性升高和稳定肺微血管内皮细胞的屏障功能的机制。我们的研究结果表明，HMGB1通过RAGE受体和p38/GSK3β/Snail和NF-κB信号通路，介导内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin和VE-cadherin的分布异常和表达下降，增加内皮细胞屏障的通透性。UFH可拮抗HMGB1的活性，抑制HMGB1与其受体的相互作用，进而维持内皮细胞屏障的完整性，为UFH的临床应用提供新的依据。