等温循环链置换聚合酶反应放大技术对基因点突变分析的研究与应用

基因组DNA中的单碱基突变与许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段。本项目针对基因组DNA中的单碱基突变研究，结合分子探针技术、生物技术以及化学、酶学、肿瘤学等多学科知识，利用聚合酶反应和切刻内切酶的切刻反应，通过连接酶技术构建一种等温循环链置换放大技术检测平台，并通过该平台实现对基因组DNA的单碱基突变的等温、快速、准确、高特异和高灵敏检测和分析。本方法的创新点在于能在较短时间内对单碱基突变基因产生一个循环放大的荧光检测信号，从而实现对检测目标的快速、等温、放大的高灵敏检测。本项目的开展不仅为临床医学和分子生物学研究提供了一种有重要应用前景的新技术，而且也是一种新的生物分析化学方法的拓展。

本项目以信号放大检测平台构建及人类疾病诊断和生物大分子检测两个科学问题为目的，基于核酸工具酶/核酸探针/核酸杂交等技术，建立了单碱基突变监测平台体系及其他多个信号放大检测平台，并用于单碱基突变、基因分型检测及核酸、蛋白质、聚合酶及重金属离子分析研究领域。建立了一种基于切刻酶介导的等温循环链置换聚合酶荧光信号放大检测平台，准确实现了对多个等位基因的准确快速的同步分析；建立了一种滚环扩增模板-挂锁探针合成的新方法和RCA扩增信号放大检测平台，提高了线性片段成环的效率，实现了对基因点突变的高灵敏检测；结合脱氧核酶、核酸工具酶和核酸荧光探针，建立了三个信号放大技术平台，分别实现了对DNA和miRNA的高灵敏检测分析；建立了基于接近诱导链置换聚合酶反应信号放大平台用于凝血酶的检测，建立了可见光多色检测平台，用于了Hg2+和Ag+的检测。本项目研制的方法和建立的体系，不仅为相关临床医学和生物学研究提供了新平台，而且对现代分析化学新方法、新技术的发展具有重要科学意义。