四环素抗性基因形成的典型环境因素影响机制分析

本课题围绕目前兽药抗性基因污染这一新的环境研究热点，针对目前兽药四环素抗性基因形成的环境影响机制报道较少的情况，拟选取国内环境中目前检出率较高的三种四环素抗性基因（tetC，tetA，tetE），采用实验室模拟试验，并利用RTQ-PCR技术进行抗性基因定量分析，开展典型环境因素对四环素抗性基因形成的影响机制研究，探讨四环素污染暴露程度、微生物多样性及自然条件（温度、光照、pH及好氧厌氧条件）等典型环境因素对环境中四环素抗性基因形成的影响规律。结果拟达到明确四环素污染与其诱导的四环素抗性基因之间否存在典型的剂量- - 效应关系，掌握典型环境因素对四环素抗性基因形成的影响规律，了解对四环素抗性基因形成主要环境影响因素及因素因子优先顺序等目标。研究结果将对建立基于四环素抗性基因污染评价的四环素环境基准，开展四环素抗性基因风险评估和污染控制，及对降低环境中抗性基因的污染风险具有较好的指导意义。

为了解四环素抗性基因污染防治途径，本研究探讨了其形成的影响机制，内容主要包括：施用含抗生素残留肥料对土壤中耐药菌种群结构和抗性基因分布的影响；诱导产生的四环素抗性基因的组成及四环素残留与耐药菌数以及抗性基因水平之间的关系；典型环境因子对四环素抗性基因形成的影响；四环素抗性基因形成的野外实际环境影响分析（洪泽湖区域调查）。结果如下：.1、分析了土壤中四环素残留和耐药菌的组成，发现猪粪样品中四环素残留为1000μg•kg-1左右，施肥土壤中四环素残留为41.1~62.0μg•kg-1，而对照土壤中四环素未检出。与对照相比土壤中四环素残留未明显改变土壤总细菌数，但提高了耐药菌数所占比例，分离的四环素耐药菌分别属于假单胞菌属等16个菌属，其中芽孢杆菌属和链霉菌属是优势耐药菌，检出率分别达到69.2%和46.2%。.2、施用肥料的土壤中四环素耐药菌菌株多含有质粒DNA，并远高于对照土壤中耐药菌菌株中质粒DNA检出率。对耐药菌株基因组DNA和质粒DNA中抗性基因进行分析，结果发现tetA、tetC和tetE在耐药菌基因组DNA中和质粒DNA上的检出率分别为47.9%，100%，0%和44.1％、97.8%和26.88%，而对照组的基因组DNA和质粒DNA中均未检出这3种抗性基因，表明抗性基因的产生可能更多来自猪粪肥的影响。四环素残留量与抗性基因含量具有明显的正相关性（R2=0.9817），表明四环素残留诱导了抗性基因的形成，而耐药菌中普遍存在的质粒有助于抗性基因的水平扩散。.3、合适的温度（25℃）、光照（500Lux）和pH（7.5）等环境条件下，土壤中四环素耐药菌菌落数和诱导形成的四环素抗性基因总量显著高于其他环境条件下（p<0.05），结果分析发现四环素抗性基因含量水平与土壤中四环素耐药菌数量之间存在着显著的正相关关系，表明耐药菌的生长对抗性基因的形成中起到了促进作用。.4、分析了洪泽湖底泥中四环素类抗生素及典型四环素类抗性基因的分布及含量情况，结果表明，四环素类抗生素残留量与有机碳含量的联合影响对四环素抗性基因的形成具有很好的线性关系（R2=0.6694，n=42），表明在野外区域内，四环素抗性基因的形成不仅受抗生素残留的影响，还可能受到有机质等其他环境因素的影响。