RNA干扰盾纤虫营养期与休眠期细胞分化关键基因的表达

Some scuticocilates are pathogenic protozoa which do great harm to the marine breeding and culture. They can cause the important diseases in industrial fish-breeding, and at present time people still have not effective and safe method to defend and treat them. Their forming resting cyst is an important method to resist the extreme environment, spread, and effectively infect the hosts. It is a premise to study the key cell differentiation genes in vegetative cell and resting cyst of scuticocilates, and then we could try to disrupt their expression and afterwards suppress their growth and differentiation. This research intends to effectively induce scuticocilates to encyst and excyst depending on the control of environmental conditions. After that, in order to find out the key genes that influence the encystment and excystment, we plan to use RNA-seq to study the differential expression genes in vegetative cell and resting cyst on the level of transcriptome. Meanwhile, this study will use RNA interference technique to induce the key genes in cyst forming silent and observe the phenotypic changes after gene silence. Through these, we could explain the corresponding gene functions and the modes they interact then try to illustrate the transformation during vegetative and resting cyst period. This research also expect to use RNAi to regulate the genes expression in the growth and cell differentiation of scuticocilates so that it could provide a new strategy in controlling and treating the ciliate diseases.

盾纤类纤毛虫是一类在海水养殖中造成重大危害的原生动物，目前尚无有效且安全的防治方法。形成休眠包囊是其抵御极端环境、传播及后期有效感染宿主的重要方式。对调控盾纤虫包囊形成与包囊解脱相关基因的研究是阻断其细胞分化关键基因的表达，抑制其生长、分化的前提。本研究拟通过对环境条件的控制实现对盾纤虫包囊形成与解脱的高效诱导，应用RNA-seq技术在转录组水平上研究盾纤虫营养期和休眠期基因表达的变化，以期寻找并克隆出影响休眠包囊形成的关键基因，以RNAi技术诱导盾纤虫形成包囊的关键基因沉默，观察基因沉默后的表型变化,注释相关基因的功能,了解其相互作用的方式，力图阐明盾纤虫营养期与休眠期细胞转化的机理，及应用RNAi方法对盾纤虫的关键基因表达进行干扰，从而达到抑制盾纤虫的生长与细胞分化的目的，为水产动物纤毛虫病的防制策略提供新的思路。

因盾纤虫病而造成海水养殖动物大量死亡的事件时常发生，在工厂化养殖的鲆鲽鱼类中尤为严重。有关盾纤虫如何应对极端环境的细胞结构及分子机理方面的研究明显缺乏。.本项目通过对几种盾纤类纤毛虫种群生长动力学的研究，初步阐明了营养和温度条件对其种群增长的影响，在研究中发现水滴伪康纤虫能在低温和营养条件不好时形成休眠包囊，进一步对包囊形成的最适条件进行了探索，发现在18℃菌液培养基中培养3d后，置于4℃，水滴伪康纤虫包囊的诱导率最高达可达60%以上。通过扫描电镜和透射电镜观察了水滴伪康纤虫的营养细胞和休眠细胞的结构，明确了休眠包囊壁的结构及内部胞器的变化情况，初步判断该休眠包囊为“毛基体非吸收型”包囊。.应用Illumina Hiseq 2500平台对水滴伪康纤虫进行了高通量转录组测序，基于数字表达谱分析了营养细胞和休眠细胞的基因表达差异。获得水滴伪康纤虫unigene 64381个，其中24951基因个得到注释，共有 17962 个unigene得到GO归类注释，有7081个unigene注释到相应的通路之下，得到CDS 935个，预测得基因ORF 2157个。数字表达谱的数据分析表明，营养期和休眠期水滴伪康纤虫各样品均产生了1200万以上的clean reads，产生的表达数据覆盖了至少18503个unigene。在休眠包囊中337个基因显示出明显的上调，110个基因出现了显著的下调。对差异基因进行GO富集后表明上调基因在生物学过程中的代谢过程和与氮复合体代谢相关的基因得到了较为显著富集，在分子功能类别中，氧化还原酶活性得到最多的富集基因。在KEGG代谢通路的分析中，有关鞭毛装配的富集程度最高，双成份系统和丙氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解通路所富集的基因数最多。由于下调的110个基因中得到注释的基因数太少且大部分的基因功能尚不明确，无法进行GO和KEGG的富集分析，因此，盾纤类的基因功能研究还需要进行更多的深入工作。.构建了水滴伪康纤虫β微管蛋白基因、ATP合成酶基因、热休克蛋白90基因和一种蛋白激酶基因的RNAi表达载体。喂食法干扰结果表明，β微管蛋白基因、ATP合成酶基因的RNA干扰具有一定的致死效应，而热休克蛋白基因和一种蛋白激酶基因的qPCR结果表明，其mRNA的表达量有不同程度的下调，但在表型上未见显著的改变。这些初步结果可为筛选RNA干扰致死表型基因奠定基础。