杨树木质部特异强启动子的筛选及其结构功能研究

在植物转基因抗虫方面,采用组织特异性表达的启动子,不但避免抗虫基因对人体或非目标生物的伤害,还可以提高抗虫效果,减少耐受性昆虫的发展。木质部纤维素合酶基因（CesA）在树木正常生长时在木质部表达，受到外界压力时在木质部和韧皮部都有表达，具有组织特异性。前期工作中，已分离得到了MDCesAP、JCesAP、YCesAP三个片段，经PLACE数据库在线预测并分析表明都有TATA box、poly(A)等启动子调控元件；功能检测表明都具有在木质部特异表达的启动子功能。本研究将通过GUS组织化学染色和荧光定量测定从3个启动子片段中筛选出组织特异性和启动功能最强的一个片段，然后采用5'端缺失分析法，利用模式植物作为转基因体系，分析此启动子不同区段驱动GUS基因在转基因植物中的表达能力和水平，明确各相关调控元件的结构与功能及相互之间的关系，为植物抗虫基因工程提供更有效的启动子和组织特异性调控元件。

本研究通过GFP荧光检测方法从MDCesAP（源于三倍体毛白杨-93、JCesAP（源于加杨-1）、YCesAP（源于意大利214杨）3个启动子片段中筛选出组织特异性和启动功能最强的一个片段JCesAP，然后采用5’端缺失分析方法，利用模式植物作为转基因体系，分析此强启动子不同区段驱动GUS基因和GFP报告基因在转基因植物中的表达能力和水平，以明确各调控元件的结构与功能及相互之间的关系、确定控制木质部组织特异性的调控元件，为植物基因调控及抗蛀干害虫基因研究提供新资料。结果如下：.对融合三个启动子和GFP报告基因的转基因材料，取茎部在荧光显微镜下观察，以野生烟草为阴性对照，以转质粒pCAMBIA1302的烟草植株作为阳性对照。阳性对照荧光显微镜下整体茎部都呈现黄绿色荧光；阴性对照为红色；3个目的基因片段融合GFP基因的转基因烟草苗嫩茎只在木质部呈现明显的黄绿色荧光，说明JCesAP、YCesAP和MDCesAP 3个片段均具有启动子活性，而且具有木质部组织特异性。另外，由JCesAP片段融合GFP告基因的烟草木质部呈现的黄绿色荧光面积最大、光强度最大，因此确定JCesAP为三个片段中活性最强的启动子。.根据强启动子在线预测分析结果设计引物。采用PCR方法分别得到距离转录起始位点不同大小的5′端缺失启动子片段(分别命名为ZU2、ZU3、ZU4)。将三片段分别替换植物表达载体Pcambia1302和 pBI121 中的 CaMV35S 启动子, 使每个片段分别与载体中GFP报告基因和 GUS 报告基因相连并转化模式植物。三个缺失片段与GFP报告基因融合的Hyg抗性植株在荧光显微镜下观察结果显示，由ZU3和ZU4驱动的GFP报告基因都有表达，而且叶脉呈现明亮的黄绿色荧光，说明都具有启动子功能，并具有木质部组织特异性，ZU2驱动的GFP报告基因表达很弱或没有表达。.为了快速检测报告基因的表达情况，同时采用瞬时转化方法将不同长度缺失体融合GUS报告基因质粒转化烟草。结果显示由ZU3、ZU4驱动的GUS在烟草叶片中有启动功能，ZU2和空白对照烟草叶片中没有观察到蓝色。初步判断缺失片段ZU3、ZU4有启动子功能，且ZU4启动子功能强度与未缺失强启动子PJCesAP功能相当，叶片表面都呈现大面积蓝色。ZU2没有明显的启动子功能。