细胞周期蛋白c对早产儿缺氧缺血性脑损伤突触可塑性的影响

The changes of synaptic plasticity are important pathological mechanisms in preterm infants with hypoxic-ischemic brain damage (HIBD). We confirmed this in our previous study and also found that the expression pattern of cyclin c(ccnc) in brain tissue changed during hypoxia ischemia. CCNC, as an important protein in G1/S checkpoint, determines whether the cell can enter the cell cycle, and are associated with the Wnt and Notch signaling pathways, respectively. However, the effect and mechanism of ccnc on HIBD synaptic plasticity in premature infants still not clear. This study intends to establish HIBD model, First of all, from in vivo and in vitro at different time points, ccnc is overexpressed and knocked down using nanocarriers, and the effects of ccnc on the neurological function of brain injury are studied by water maze test; Secondly, the changes of synaptic structure were detected by electron microscopy and Golgi staining; Thirdly, the changes of membrane potential and ion channels in brain slices and cultured neurons are analyzed using patch-clamp technique ; Finally, by interfering with the Wnt and Notch pathway key node proteins, analyze the relationship between ccnc and the important signal pathway of synaptic plasticity in HIBD. Furthermore, gene knockout, EMSA cells and CHIP are used to analyze the protein interaction and cross-talk mechanism between the signal pathways. We want to provide possible molecular targets and time windows for the treatment of HIBD in preterm infants.

突触可塑性改变是早产儿缺氧缺血脑损伤（HIBD）的重要病理机制，我们前期证实该点的同时发现脑细胞周期蛋白C（ccnc）在缺氧缺血时表达模式有改变，ccnc作为G1/S检查点重要蛋白，决定细胞能否进入细胞周期，并分别与Wnt和Notch信号通路有关联，但ccnc对早产儿HIBD突触可塑性的影响及其机制尚不明确。本研究拟建立HIBD模型，从在体和离体不同时间点，经纳米载体过表达或敲低ccnc，通过水迷宫实验等探讨ccnc对脑损伤神经功能的影响；电镜、高尔基染色等探讨突触结构等的变化；脑片和培养神经元膜片钳技术探讨膜电位和离子通道的变化；通过干预Wnt和Notch通路节点蛋白，分析HIBD时ccnc与突触可塑性重要信号通路（Wnt和Notch）的关系，进一步用细胞基因敲除、EMSA和CHIP等进行蛋白互作研究，并分析此过程中通路之间的串话机制，为早产儿HIBD的治疗提供可能的分子靶标和时间窗。

细胞周期蛋白C（ccnc）在缺氧缺血时表达模式有改变，ccnc作为G1/S检查点重要蛋白，决定细胞能否进入细胞周期，并分别与Wnt和Notch信号通路有关联，但ccnc对早产儿HIBD突触可塑性的影响及其机制尚不明确。..本研究建立未成熟大鼠缺氧缺血模型，进行神经行为评估，结果提示，敲低ccnc能够在一定程度上改善HIBD大鼠生长发育情况、空间学习能力及四肢抓握能力，过表达ccnc可能使HIBD大鼠的运动协调能力下降。成功建立大鼠海马脑片培养和神经元细胞培养模型，研究缺氧缺血后经过ccnc干预处理后的不同时间点神经元突触功能的改变。..在体实验通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR研究ccnc的表达。敲低ccnc或给予GSK-3β抑制剂，通过TUNEL研究ccnc对脑损伤后细胞凋亡的影响；研究凋亡蛋白Bcl-2和Bax及突触蛋白Synapsin-1和PSD95的表达，通过电镜观察其对脑损伤远期突触的影响，研究其对GSK-3β、GSK-3β-p（Ser9）、β-catenin、Notch1、Hes1和Hes5的影响；结果提示，缺氧缺血后，其表达增加，可能通过上调GSK-3β的活性抑制下游的Wnt信号通路并激活Notch信号通路，从而参与缺氧缺血脑损伤。这表明敲低ccnc或抑制GSK-3β（TWS119） 对未成熟大鼠缺氧缺血脑损伤起神经保护作用。..基于上述研究，我们进一步发现ccnc在神经元成熟过程存在核浆转移，提示其在发育不同阶段在不同位置发挥不同作用，参与神经元成熟过程；另外，探讨ccnc对未成熟大鼠缺氧缺血脑损伤脑结构和功能的影响。生后第二天（P2）埋置脑电和肌电电极，在P4-P8分别记录2小时。结果提示，敲低ccnc在癫痫发作频次、持续时间和平均发作时间上无影响，但是脑电图背景电压功率较HI组和NC组恢复早。在早期神经发育评估中，敲低ccnc组优于ccnc组和NC组。与SHAM组比，HI组在P4-P12期间快速动眼睡眠（REM）所占百分比降低，非快速动眼睡眠（NREM）和觉醒所占比较高。缺氧缺血诱导后，REM和NREM睡眠的出现频率增加但持续时间缩短，随日龄增加，逐渐恢复到正常睡眠。缺氧缺血脑损伤改变了神经发育过程中的睡眠觉醒周期。..通过以上的研究，从一个新的角度研究缺氧缺血脑损伤以及修复的相关机制并为日后用于临床治疗提供可能的新靶