单碱基特异性末端转移酶（TdT）的设计及其在基因合成中的应用

Gene synthesis is one of the key technologies in synthetic biology and precision medicine, the cost of which can be reduced by the efficient and accurate synthesis of long oligonucleotides. Comparing to the classical chemical catalysis, the oligonucleotide biosynthesis by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) has been proven to be an advanced strategy with high specificity and mild reaction conditions, which effectively reduces the number of steps in each cycle of solid phase synthesis, and improves the theoretical maximum efficiency of each cycle, leading to a potential to achieve a great enhancement in length and accuracy of oligonucleotide products. In this project, the key enzyme TdT will be investigated and the molecular mechanism of its base-specificity will be explored by computational simulation. Based on this mechanism, a single-base specific TdT will be designed by regulating interactions between proteins and substrates. Mutant libraries will be screened by high-throughput screening strategies. Single-base specific TdT mutants will not only improve the catalytic efficiency but also avoid synthetic errors caused by reagent residue, resulting in an increase of the length and the accuracy of oligonucleotide products, moreover a reduction of the cost of the subsequent gene synthesis.

基因合成是合成生物学和精准医疗等领域的关键支撑技术之一，其成本的降低依赖于高效率高准确度长寡核苷酸的合成。在寡核苷酸合成技术中，基于末端转移酶（TdT）的生物法相比于传统化学法具有特异性好反应条件温和的特点，可以有效地减少固相合成中每个循环的步骤数，提高单循环理论最大合成效率，有潜力实现寡核苷酸产物长度和准确度的飞跃。本项目以关键酶TdT为研究对象，先通过计算机模拟等手段探究其碱基特异性的分子机理，在此基础上调控蛋白-底物分子间作用力，设计只对某一种碱基具有高活性的单碱基特异性TdT突变体库，然后通过高通量筛选等实验手段对上述突变体库进行筛选，以期得到具有单碱基特异性的TdT突变体。将这种新型TdT突变体应用于寡核苷酸合成，既可以提高催化效率又可以避免试剂残留产生的合成错误，因而将会提高寡核苷酸产物的长度和准确度，进一步降低后续基因合成的成本。

本项目为了研究酶催化的生物法基因合成，对末端转移酶（TdT）的碱基特异性机理进行了研究，并通过蛋白工程手段对其催化效率进行了提升；同时，为了拓展更多的生物法基因合成的技术路线，本项目还针对DNA聚合酶和DNA连接酶进行了研究。 .1 本项目通过分子动力学模拟及结构分析，对TdT的底物结合过程、底物结合通道及碱基特异性机理进行了研究，结果揭示了TdT结构中的一个狭长的，极性的，有一个柔性loop结构域作为门控的通道是核苷酸底物进入催化活性中心的路径，这条路径上的一系列精氨酸是引导底物结合的关键氨基酸。但由于在这个路径中，底物进出的引导基团是三磷酸基团，对碱基结构的区分度不大，给我们对于TdT碱基特异性的研究和设计带来了困难。同时，本项目还对尿素变性核酸电泳及毛细管电泳法进行了条件优化及实验设计，可以高灵敏度高分辨率地检测TdT的单碱基转移活性。同时开发了基于荧光能量共振转移的酶活性检测方法，可以对末端转移酶的催化进行实时检测。最后，我们还探索了基于纳米孔检测器的单分子检测法。.2 本项目对TdT的修饰碱基催化活性进行了突变体设计及筛选，完成了299个突变体的设计，>200突变体的制备筛选，得到了一系列相较野生型催化活性有所提升的突变体。其中，最优突变体将野生型蛋白的28%的转化率提升至了65%。最后，将筛选得到的最优突变体应用在固相法DNA合成中，并对该技术流程进行了条件优化，实现了3nt寡核苷酸的合成。.3 除了TdT介导的生物法基因合成路线，本项目还关注了当前生物法基因合成技术中的其他瓶颈问题，研究了其他的生物法基因合成技术路线中可能发挥重要作用的DNA聚合酶和DNA连接酶。本项目利用机器学习辅助定向进化技术，对DNA聚合酶的修饰底物催化活性进行了提升。本项目还利用理性设计手段，对DNA连接酶对末端修饰DNA片段活性进行了优化。