连翘酯苷A调控干扰素抑制牛病毒性腹泻病毒复制作用及机制研究

BVDV can inhibit IFN-Ⅰ and IFN-Ⅲ，leading to persistent infection and great loss. Forsythiaside A (FTA) can inhibit BVDV replication and adjust the excessive expression of IFN-γ. The research will be carried out about the role and mechanism of inhibition of BVDV replication by forsythiaside with BMDCs in vitro and in vivo with the Balb/c mice. In vitro, the BMDCs will be exposed to BVDV and FTA. The mechanism of inhibition of BVDV replication by forsythiaside A via JAK-STAT and negative protein will be studied with Western blot, RT-qPCR and siRNA during BVDV infection. The key factors will also be screened. In vivo，the mice will be treated with BVDV and FTA. The pathological change, the condition of humoral immunity and cellular immunity of the mice will be observed with biopsy, viruses neutralization and flow cytometry. The research will clarify the mechanism of FTA inhibiting BVDV replication and provide theoretical basis for the application of FTA and BVDV prevention and control.

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）能抑制IFN-Ⅰ和IFN-Ⅲ产生，引起持续性感染，造成重大损失。前期研究显示连翘酯苷A（FTA）体外能抑制BVDV复制，调节IFN-γ过度表达。本项目将以小鼠骨髓源的树突状细胞（BMDC）和Balb/c小鼠为模型，从体外和体内两个方面，进一步研究FTA抑制BVDV复制的作用机制。体外试验以BMDC为模型，通过BVDV处理和添加FTA，利用Western blot、RT-qPCR和siRNA等技术研究探索FTA通过JAK-STAT和负调节蛋白抑制BVDV复制的机制，筛选发挥主要调控作用的因子。体内试验使用BVDV和FTA单独及联合处理小鼠，通过病理分析、病毒中和和流式细胞术等技术手段，观察小鼠器官组织的病理变化、体液免疫和细胞免疫状况，阐明FTA保护小鼠抗BVDV感染的作用和机制，为FTA的应用和BVDV的防控提供理论依据。

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrheal virus，BVDV）能够感染牛、羊、猪等多种动物，给畜牧业造成重大损失。本病毒不仅能够导致严重的急性感染和黏膜病，也可以引起持续性感染，不断的向环境和后代排毒，造成免疫抑制，继发持续性损失。引起持续性感染的机制有很多，主要是抑制I型干扰素的产生。由于BVDV的基因型和生物型众多，抑制干扰素产生的机制也不尽相同。对于BVDV的防治，连翘脂苷A(Forsythoside A，FTA).也发挥重要的作用。申请人前期已经发现FTA具有抑制BVDV在细胞内复制的作用，本研究继续深入探索FTA对BVDV抑制作用的具体机制，为FTA的进一步应用打下基础。.研究通过两种不同类型的细胞，RAW264.7和MDBK，从不同角度进行分析FTA对BVDV感染免疫细胞和非免疫细胞引起的干扰素变化，研究FTA抑制BVDV感染的机制。通过qPCR、Western Blot等方法检测BVDV蛋白的表达水平、细胞中干扰素相关信号通路转录水平以及蛋白水平的变化，寻找FTA对BVDV增殖产生抑制的关键蛋白因子以及作用方式，通过我们的研究发现经过筛选的100 μg / mL的FTA，对BVDV无直接杀伤作用，对BVDV吸附、穿入和释放均无影响。FTA对BVDV具有明显的抑制作用，并且在BVDV吸附2 h后添加FTA，并使其持续存在的方式抑制效果最佳。FTA添加后能显著抑制BVDV在MDBK细胞中增殖。BVDV在RAW 264.7细胞中并不能进行增殖，并且作为免疫细胞RAW 264.7细胞对BVDV产生免疫反应。.通过对感染过程中的免疫因子的表达水平发现，FTA能够抑制干扰素的过度表达，而且FTA能够明显降低BVDV引起TLR7及其相关信号的分子的高表达，FTA抑制BVDV感染过程中引起的干扰素负调控因子SOCS1的升高。BVDV增殖会引起IRF7增多，BVDV感染后IRF7易位进入细胞核，而FTA作用后抑制了IRF7的入核作用。构建shIRF7慢病毒转染系统，IRF7敲低细胞相比正常MDBK细胞中BVDV的增殖被抑制。.通过本研究，FTA在MDBK中的抑制作用是通过TLR7-IRF7介导的信号通路实现的，IRF7是本过程的一个重要因子，具体的作用蛋白和机制也将进一步深入研究，为BVDV的防治提供进一步的参考。