被子植物花粉母细胞自噬现象及其机理和功能的研究

自噬(AP)是真核细胞在正常生长发育或遭受营养、生物和非生物胁迫时细胞质组分降解和再利用的方式之一，在维持细胞的静态平衡，发育模式重构、自体免疫、抗氧化胁迫等方面发挥重要作用。早期研究主要集中在酵母，近年来在植物中有所增加，但主要集中在植物的根尖、叶肉等营养组织或细胞。本项目拟在我们近期研究-在蜀葵和油菜雄性可育(MF)和不育(MS)系花粉母细胞(PMC)中发现有类似自噬体和多泡体样结构存在的基础上，以其他植物的MF和MS株为材料，结合自噬体(AS)特异标记染色、AP特异抑制剂处理、免疫组化、激光共聚焦术、超微结构观察、AP相关基因表达分析、RNAi等技术，通过分析比较MS和MF系PMC减数分裂过程中AS的形态结构、分子标记、形成和转运机制、基因表达调控等等，探讨AP在正常雄配子体发生和MS花粉败育过程中的作用，对于了解AP在植物正常生长和发育过程中的作用具有重要意义。

为探讨在雄性不育（MS）和雄性可育（MF）植物小孢子发生过程中自噬现象的普遍性、动态及分子机制，本项目 1）显微和亚显微结构观察发现，洋葱、油菜、蜀葵雄性可育(MF)和不育(MS)系花粉母细胞(PMCs)内均存在数量、形态、大小不同的自噬体(AB)、自噬泡(AV)和多泡体(MVB)结构，MS系植物PMC内的AB、AV和 MVB结构较MF系更为丰富多样。除此而外，MS系PMCs胼胝质壁合成受阻，细胞畸形，最终在四分体形成之前解体； 2)用自噬泡特异染料剂DMC染色结合激光共聚焦显微镜观察发现，早期油菜、蜀葵、洋葱和百合的PMCs细胞质均存在数量，大小、分布和强度不等的亮蓝色荧光斑点， MS系PMCs细胞质内斑点的数目多于在MF系PMCs内的数目； 3) 超微结构观察发现，碳饥饿胁迫下油菜根尖伸长区表层细胞可看见大小不等的AB、AV结构，但其形态、结构、数量与PMCs中的明显不同；4）从油菜和蜀葵中克隆出了3个自噬相关基因(BnAtg8a, BnAtg8b、ArAtg8)，分析了相关的生物信息；5)RT-PCR和半定量RT-PCR检测发现，Atg8基因在油菜、洋葱、蜀葵的MS和MF系花药及其他营养组织中均有表达，但在花药中的表达水平明显高于在营养组织中的表达水平，在MS系PMC期花药中的表达水平略高于在MF系PMC期花药中的表达水平； 6)构建了BnAtg8a和pBnAtg8aGFP表达载体，并分别导入MS和MF系基因组，共获得33个BnAtg8a和BnAtg8aGFP转基因株。这些转基因植株在株高、分支、结荚期、果荚的数量、形状、大小、饱满度、种子数等方面与对照明显不同；7）构建了BnAtg8a原核表达载体，并诱导其在大肠杆菌中表达。以上结果进一步证实 1）自噬的确在植物PMC的发育过程中出现，其存在具有一定的普遍性；2）自噬在MS系PMCs中的作用与PMCs 败育有关，在MF系中的作用后者可能与消除早期因随机不对称分裂导致的细胞质的异质性有关；3)自噬相关基因Atg8可能具有多重功能，不仅与植物细胞的自噬过程有关，也可能在植物其他的细胞和生理过程中发挥一定的作用.