Cul2/miR-424反馈环路在HPV E7蛋白致癌过程中的调控作用及机制

Cervical cancer is one of the most common gynecological malignancies in women around the world, prevention is still grim task. We previously that demonstrated miR-424 was an important tumor suppressive miRNA in cervical cancer. Our current study have showed that Cul2 is a target gene of miR-424, and Cul2 could negatively regulate miR-424 level. Moreover, we found that expression of cul2 was significantly positively related to expression of HPV16 E7, while miR-424 level was negatively correlated with HPV16 E7. Therefore, we assume there exist an "miR-424-Cul2-transcription factor-miR-424 feedback regulation loop" in HPV16 positive cervical cells. We use a variety of molecular biology techniques, one by one to prove a direct or indirect role in every aspect in the loop, and finally through the tissue samples to verify the results of the cellular level, thus proving that the feedback loop between miR-424 and Cul2 amplifies the effects of the HPV oncoprotein. The aim of project is to expand the understanding of the role and mechanism of miRNA-mediated signaling pathways in cervical cancer, and provide experimental evidence to look for cervical cancer prevention and treatment targets.

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。我们已在Oncogene上发文首次证明miR-424是一个肿瘤抑制性miRNA。前期研究又发现， Cul2是miR-424的下游靶基因，Cul2又可反馈性负向抑制miR-424表达，提示可能存在"miR-424-Cul2-转录因子-miR-424"反馈性调控环路。本项目通过细胞模型，利用免疫共沉淀和质谱分析等多种分子生物学技术，首先明确miR-424对下游靶基因Cul2的负向调控及Cul2对E7功能的影响；然后确定特定的转录因子、并证实Cul2对转录因子和转录因子对miR-424的直接转录调控作用，从而证明反馈环路的存在。旨在从miRNA介导的信号通路揭示宫颈癌发病的关键机制。

我们前期研究已经证实miR-424在宫颈癌发生发展过程中发挥抑癌功能，但对宫颈癌miR-424持续性低表达的原因并不清楚。宫颈癌作为病毒相关肿瘤，已知HR-HPV E7蛋白可干扰抑癌蛋白Rb与转录因子E2F的结合而导致细胞增殖周期的紊乱，这一反应被认为是E7转化活性的关键。本研究首先通过软件预测发现转录因子E2F1在miR-424转录起始位点上游2000bp内有2个可能识别位点。在此基础上我们利用荧光素酶报告基因检测、染色质免疫共沉淀和qRT-PCR证实E2F1是miR-424的直接上游分子，抑制miR-424的表达。其次，我们通过预测软件、qRT-PCR、western blot和荧光素酶报告基因检测发现Cul2是miR-424的直接下游靶基因，miR-424低表达导致Cul2高表达。同时，我们又发现Cul2也能反馈抑制miR-424的表达。因此，推测Cul2与miR-424之间可能存在反馈环路。进一步研究发现，高表达Cul2能够正向调控E2F1的表达，免疫共沉淀实验显示Cul2能够与E2F1结合，从而证明Cul2、E2F1和miR-424之间调控环路的存在。在此基础上，我们进一步对Cul2和E2F1的生物学作用如细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡进行深入研究， 继而对Cul2/E2F1/miR-424调控环路进行全面的功能验证。通过本项目研究，明确了宫颈癌细胞中Cul2/E2F1/miR-424调控环路的存在，并对环路成员进行了功能探讨，取得了较好的实验成果，揭示了导致宫颈癌细胞miR-424持续性表达抑制的原因，并从miRNA层面为发现能够阻断宫颈癌发生的新靶点提供了实验依据。本项目按要求完成，参加国际学术交流并进行大会报告1次，培养博士研究生和硕士研究生各1名，并资助研究团队成员赴美国进行交流访问。