microRNAs介导人结肠癌淋巴管生成的作用及机制研究

结肠癌已成为严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤，其高侵袭转移特性与肿瘤诱导淋巴管生成密切相关，探寻肿瘤淋巴管生成的分子调控机制是抗结肠癌侵袭转移的重要课题。我们将从miRNA的层面揭示人结肠癌淋巴管生成的调控机制，通过比较未处理的淋巴管内皮细胞和肿瘤诱导过的淋巴管内皮细胞的miRNA表达谱，筛选出人结肠癌淋巴管生成相关的miRNA，确定人结肠癌淋巴管生成相关miRNA作用的靶基因，以进一步阐明人结肠癌淋巴管生成的分子机制。并在体外试验中观察人结肠癌淋巴管生成相关miRNA对淋巴管生成的影响，为体内试验作铺垫。该项目将是国内外首次从miRNA调控水平来阐明人结肠癌淋巴管生成的分子机制,为抗肿瘤淋巴管生成提供了崭新的思路。

淋巴管生成相关miRNA的研究几近空白。寻找人结肠癌淋巴管形成相关miRNA，探讨miR-27a在人结肠癌淋巴管形成过程中的潜在功能，进一步预测并验证miR-27a的靶基因及其功能。运用miRNA芯片检测干预后的HLEC，筛选差异miRNA，利用qPCR法进行验证。通过软件预测miR-27a可能调控的靶基因。根据miR-27a结合候选靶基因的3’UTR位点，构建相应的报告基因载体及突变体转染至HLEC中，检测报告酶变化情况。将不同浓度过表达的靶基因载体及靶基因siRNA转染入HLEC中，观察其淋巴管形成情况并比较。miRNA芯片发现2倍以上表达上调的miRNA共21条，2倍以上表达下调的miRNA共26条。实时定量荧光PCR法验证其中4条和miRNA芯片结果相一致。30.00nM和60.00nM的miR-27a mimic的HLEC管样形成长度为对照组的5.13±0.79倍和8.18±1.32倍，HLEC的迁移细胞数分别为对照组的1.85±0.40倍和3.19±1.16倍。反之，30.00nM和60.00nM的miR-27a inhibitor的HLEC管样形成长度为对照组的46.93±7.36% 和93.63±0.87%，HLEC迁移细胞数分别较对照组减少30.54±11.38% 和55.52±5.22%。miR-27a antagomir干预后的裸鼠移植瘤体积较对照组生长缓慢并且体积明显缩小，干预组移植瘤的微淋巴管密度较对照组明显降低。生物信息学分析结果显示Smad4可能为miR-27a的靶基因。随着miR-27a mimic浓度的增加SMAD4蛋白的表达减少，而随着miR-27a inhibitor浓度的增加SMAD4蛋白的表达增加。荧光素酶报告基因实验结果显示，与突变组相比，上调miR-27a后，Smad4野生组的荧光素酶值随着miR-27a浓度的不同分别下降了42.33±7.02%和56.67±7.77%。p3TP-Lux报告系统进一步证实miR-27a作用于TGF-β通路。随着HLEC中Smad4的表达上调，淋巴管的形成显著减少，而随着Smad4的表达下调，淋巴管的形成显著增加。miR-27a通过作用于Smad4促进人结肠癌淋巴管的形成，可能作为抑制结肠癌生长转移的新的重要治疗靶点。