细胞内环境响应释药系统的肿瘤基因治疗基础研究

The high gene transfection of the non-viral gene delivery system is importance premise to realize the efficient gene therapy. In this project, we designed an in vivo stable nano carrier, which display excellent uptake ability by targeting cells and cellular nucelus import ability. Through the hydrophilic polysaccharides was conjugated with octadecylamine by disulfide linkage, a novel intracellular splendid glutathione-responsive glycolipid-like gene delivery vector should be formed. The relationship between the effective distribution in vivo, tumor targeting, excellent cellular-uptake and the active targeting modification of the vector will be studied. There are also explored the inherent law of the modification of the histidine and disulfide bonds of shell-sheddable micelles with the genes escaping from endosome and intracellular release. By the research of gene transfection on tumor model cell lines and tumor model animals, we investigated the relevance between biological targeting and gene transfer efficiency. As considered to be biological stabile and safe, we further expounded the inherent law of both in vitro and in vivo gene therapy. This study will provide new idea, strategy and approach for efficient gene transfection and tumor gene therapy of non-viral gene delivery system, and enlarge and develop the gene therapeutical theory of non-viral gene delivery system.

非病毒载体的高效转染，是实现基因有效治疗的重要前提。本项目采用体内稳定、靶细胞高效摄取、具有细胞核趋向性的纳米载体，通过亲水性多糖与疏水性脂链之间的二硫键化学链接，形成靶细胞内高谷胱甘肽浓度响应性新型糖脂载体基因给药系统。研究基因给药系统主动靶向修饰与体内有效分布、细胞高效摄取之间的相关性，探索基因给药系统的外壳卸载型二硫键修饰、pH响应组氨酸分子修饰，促进基因在细胞内的谷胱甘肽敏感释放及内涵体逃逸的机理。阐明基因给药系统的理化性质、空间结构与体内分布、细胞摄取、细胞内基因释放，及细胞核趋向性之间的相互关系。在基因给药系统生物稳定性、安全性研究的基础上，通过肿瘤模型细胞和肿瘤模型动物的基因转染与基因治疗研究，探明基因给药系统生物靶向、基因转染效率与基因治疗疗效之间的内在规律性，为非病毒载体的高效基因转染与基因治疗研究，提供新思路、新策略和新方法，丰富和发展非病毒载体基因治疗理论体系。

本项目利用肿瘤细胞内外还原型谷胱甘肽（GSH）的浓度差异（100~1000倍），以及肿瘤细胞与正常细胞之间的浓度差异（7~10倍），构建了一种选择性响应肿瘤细胞内外氧化还原电位差的智能型药物载体，实现药物高效安全递释。以二硫键为桥链，以壳聚糖为亲水链、硬脂胺为疏水链，合成具有氧化还原响应性的糖脂嫁接物CSO-ss-SA。CSO-ss-SA可在水性介质中自聚集，形成类球形胶束；在10mM GSH还原条件下发生胶束解聚，具有典型的还原敏感性。CSO-ss-SA胶束，表面带正电，可有效密接基因。构建了基于CSO-ss-SA胶束的共递释系统，分别用于递释小分子干扰RNA（siRNA）和紫杉醇（PTX），并在10mM GSH还原条件下快速释放密接的siRNA。肿瘤细胞内，嫁接物胶束能有效递释siRNA，具有内-溶酶体逃逸功能。响应肿瘤细胞内氧化还原电位差释放siRNA，细胞内靶基因表达沉默效率为85.8%，实现有效沉默。以MCF-7细胞及其耐药细胞MCF-7/ADR为模型细胞，CSO-ss-SA胶束密接特异性针对 B细胞淋巴瘤（Bcl-2）靶序列的 siRNA同时包封PTX，该共递释系统可通过高效的细胞周期阻滞效应，实现协同增效治疗，并克服细胞耐药。为减少网状内皮系统吞噬，进一步提高抗肿瘤疗效，本课题构建了PEG化的二硫键糖脂嫁接物（PEG-CSO-ss-SA）作为基因治疗载体，应用于pDNA的递释。PEG-CSO-ss-SA胶束可有效密接pDNA，并保护pDNA免受核酶降解，可响应10mM GSH还原条件，快速释放所密接的DNA。PEG的表面修饰明显降低巨噬细胞吞噬，并能有效转染肿瘤细胞，其转染效率与阳性对照脂质体相当。PEG-CSO-ss-SA嫁接物胶束可递释表达野生型p53质粒，有效上调细胞内p53表达，并诱导肿瘤细胞凋亡，且其诱导凋亡的能力与细胞内谷胱甘肽浓度呈正相关。体内研究表明，PEG修饰后可延长嫁接物胶束在体内的循环时间，增加其在肿瘤部位的蓄积。尾静脉注射PEG-CSO-ss-SA密接p53质粒复合物，可检测到肿瘤内质粒表达，发挥促肿瘤细胞凋亡能力。研究结果表明，CSO-ss-SA及 PEG-CSO-ss-SA嫁接物及其基因复合物，在肿瘤细胞内可有效递释siRNA及pDNA，发挥药效，为非病毒载体的高效基因转染与基因治疗研究提供新策略和新方法。