TATp与P-selectin修饰的载双基因靶向超声造影剂用于心肌缺血分子成像与治疗研究

基于申请者前期研究发现，自制载基因及穿膜肽脂质超声造影剂具有明显的造影增强效果，且具有较强结合基因能力，能够提高基因转染效率，可为心肌缺血影像学诊断和基因治疗提供一种新策略。但是，载基因及穿膜肽超声造影剂仍然缺乏心肌缺血靶病变聚集成像的能力，导致成像质量欠佳，基因转染准确性不足。因此，申请者设想采用成膜-水化结合冷冻-熔融超声法,制备一种TATp与P-selectin修饰的同时具有细胞外积聚和细胞内渗透作用的载双基因靶向超声造影剂，通过体内外实验评价该靶向超声造影剂的寻靶能力和分子成像效果，并运用超声靶向破坏微泡技术进行体外基因转染和体内基因治疗的实验研究，可集诊断、治疗和监控于一体，从而实现超声分子影像学诊断与治疗心肌缺血的目的。预期成功制备TATp与P-selectin修饰的载双基因靶向超声造影剂，为超声分子成像诊断及超声靶向破坏微泡技术介导基因治疗心肌缺血提供一种新思路和新手段。

按照年度计划，本课题组进行了相关的体外和体内实验。①采用Nа-芴甲氧羰基 (Fmoc) 法固相合成穿膜肽新序列，合成的穿膜肽纯度为96.13%，相对分子量为2348.42，流式细胞仪及共聚焦显微镜结果显示荧光标记的穿膜肽能够进入细胞内，穿膜肽能够携带质粒进入细胞并表达，而且对细胞的活性没有明显影响，琼脂糖凝胶电泳结果显示穿膜肽与质粒有很强的亲和性，并对质粒具有保护作用。②采用机械振荡法制备靶向载基因及穿膜肽超声造影剂，激光共聚焦显微镜显示穿膜肽和质粒DNA均匀地分布在超声造影剂壁上。通过免疫荧光法在荧光显微镜下观察到靶向超声造影剂表面呈红色荧光。体外寻靶实验显示靶向组超声造影剂牢固地结合在缺氧HUVEC周围；流式细胞仪检测靶向组大约有73.80%的细胞表面结合有该靶向超声造影剂。③ 制备的P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂平均粒径约（2.15±0.36）µm，浓度约为（1.58±0.23）×107 个/ml，分布均匀，基因和穿膜肽的包封率分别为28%和25%。转染24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达，测得转染率高于非靶向组。④采用“生物素-亲和素”桥接法制备携抗P-selectin靶向超声造影剂，平均粒径为（2.24±0.71）μm，平均Zeta电位为（-2.75±0.84）mV，浓度为（3.0±0.3）×109个／ml，抗体结合率高达99.80％；免疫荧光检测结果显示rhIL-4和组胺能成功刺激HUVECs表达P-selectin，并探寻出rhIL-4最适刺激剂量；体外寻靶实验显示靶向超声造影剂能较好地粘附在缺氧的HUVECs表面。⑤ 成功制备携抗P-selectin靶向超声造影剂及建立犬心肌缺血再灌注模型，彩色编码图像显示MBp行心肌声学造影可于缺血再灌注区心肌见显著造影增强，MBc于缺血再灌注区心肌造影无明显增强。本课题共发表论文9篇，其中1 篇SCI。