多不饱和脂肪酸对软骨基质金属蛋白酶-13分泌的影响及其机制研究

本课题主要针对关节软骨退变的机理进行解析，同时利用超临界二氧化碳技术等手段萃取油脂，确定ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）的最佳配比来预防软骨退变，并探讨其作用机制。通过硝酸银络合法分离纯化ω-3PUFAs；采用分子蒸馏法纯化ω-6PUFAs，用气相色谱法分析不同油脂脂肪酸构成，并按比例进行调配。采用电镜观察不同配比油脂对软骨细胞的影响，MTT法检测细胞增殖能力变化，Tunel法检测细胞凋亡情况，硝酸还原法检测一氧化氮释放水平，聚合酶链反应和免疫印迹方法分析软骨退变中的关键酶（MMP-13）的表达变化，从分子水平揭示ω-3PUFAs调控软骨分泌MMP-13的信号通路。建立关节炎动物模型，通过饲养不同配比的脂肪酸膳食进行干预，用免疫组织化学染色的方法测定炎症组织局部的MMP-13的含量，从整体动物水平确定ω-6/ω-3PUFAs的最佳配比，为进一步开发防治软骨退变的油脂食品奠定基础。

背景：骨关节炎（OA)是中老年人的常见关节疾患，主要表现为关节软骨退变、磨损、骨质增生。基质金属蛋白酶-13（MMP-13）在关节炎发病中起到非常重要的作用，目前研究已证实：众多炎症因子最后作用的靶分子是MMP-13，MMP-13特异性降解软骨基质中的II型胶原，起到破坏关节软骨的作用。多不饱和脂肪酸（PUFAs）可分为n-3PUFAs和n-6PUFAs，研究证明一定比例的脂肪酸膳食在防治心血管疾病、糖尿病、炎症性肠病、风湿性疾病和癌症等方面都有一定作用，但在OA中的作用尚不清楚。.主要研究内容：（1）n-6PUFAs及n-3PUFAs的分离及纯化的研究；（2）不同配比n-6/n-3PUFAs对软骨细胞MMP13表达的影响及其机制研究；不同配比n-6/n-3PUFAs膳食对骨关节炎大鼠关节软骨破坏程度的影响研究；（3）n-3PUFAs对关节软骨退变的抑制机制和细胞通路研究。.重要结果及关键数据：（1）酶水解火麻油优化提纯PUFAs的条件为水油比15:1，酶添加量952 U/g，pH 6.62；（2）较低的LA/ALA (n-6/n-3PUFAs)配比在体外实验中可降低软骨细胞中MMP13的mRNA和蛋白水平的表达，但并不影响软骨细胞的增殖水平；体内实验中，1:1及2:1比例的n-6/n-3PUFAs比值可显著降低大鼠的足跖肿胀率，以及血清MMP13、IL-1表达水平。组织学染色证实1:1和2:1的PUFAs比值显著减轻佐剂性关节炎大鼠的软骨损伤程度。1:1的n-6/n-3 PUFAs比值对MMP13表达的抑制作用最强。（3）在体外实验中，RT-qPCR、ELISA以及Western-blot等实验结果表明，在SW1353细胞系中，DHA（n-3PUFAs）可减少MMP13 mRNA和蛋白的表达。通路实验证实，DHA引起MMP13表达量减少的机制是通过对于p38 MAPK通路中p-p38蛋白的抑制。.科学意义：本课题通过体外实验及动物实验，明确了对于OA关节软骨退变起到抑制作用的膳食n-6/n-3PUFAs比值，对于OA病人的食疗具有指导意义；通过对于细胞通路的研究，证实n-3PUFAs通过对于p38 MAPK通路的抑制减少了MMP13的表达，对于OA发病机制的深入研究，具有一定的指导意义。