白念珠菌分泌的诱导宿主免疫细胞凋亡的新因子的纯化及功能研究

白念珠菌的致病性与其分泌的众多毒力因子有关。我们前期研究从白念珠菌培养上清液中分离到一种新型蛋白，能特异性结合于人类单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞，并进入细胞内诱导凋亡，命名为SIIF。但是SIIF的蛋白属性和诱导凋亡的机制尚未阐明。本研究我们将采用新的蛋白分离方法进一步纯化SIIF，明确SIIF的蛋白属性及其序列；用URA-blaster法构建白念珠菌Δsiif无效突变株，观察其是否丧失诱导细胞凋亡的能力，从而用基因在体（离体）功能分析的方法验证SIIF独特的细胞毒性作用；用细胞吞噬抑制剂阻止上述细胞对SIIF的吞噬，并观察细胞凋亡的情况，从而用反证法阐明SIIF进入细胞与凋亡信号活化之间的关系，为揭示SIIF诱导凋亡的机制奠定基础。鉴于上述三种细胞在宿主抗真菌感染中的作用极为重要，对SIIF的研究将有助于我们更好地理解白念珠菌感染的致病机制及宿主抗真菌感染的免疫防御机制。

我们前期研究从白念珠菌培养上清液中分离到一种蛋白混合物，能特异性作用于人类单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞，并诱导细胞凋亡，命名为SIIF。但是SIIF的蛋白属性和诱导凋亡的机制尚未阐明。本研究我们将采用多种分离方法进一步纯化蛋白，并检测其诱导单核细胞凋亡的活性。结果明确SIIF的性质为分泌型天冬氨酸蛋白酶6（sap6）；利用白念珠菌sap6无效突变株，发现该突变株丧失诱导单核细胞凋亡的能力，同时siif回复株能够恢复诱导单核细胞凋亡的能力，结果证实sap6能够诱导人单核细胞凋亡；为了分析sap6诱导凋亡信号传导的机制，在荧光显微镜下观察sap6与单核细胞结合的位置，发现sap6可以进入细胞，结合于细胞内。通过分析凋亡级连反应蛋白的活化情况，发现sap6诱导单核细胞凋亡过程中，caspase3、caspase9和细胞色素C活化，同时caspase3、caspase9抑制剂可以逆转凋亡反应。该结果证实sap6通过内源性信号传导通路诱导单核细胞凋亡。sap6进入单核细胞的途径需要进一步探索。