丝状真菌蛋白分泌途径中内质网压力反馈机制的研究

异源蛋白的表达、培养条件改变、化学药物处理等应激条件将影响真核生物蛋白分泌途径内质网中蛋白的正确折叠，导致内质网压力，并诱导非折叠蛋白应答机制(UPR)控制。与哺乳动物细胞相比，丝状真菌UPR正调节同样具有增加蛋白折叠分子伴侣和修饰酶的量效应,但其负调节效应却是丝状真菌是特有的分泌压力在转录水平抑制分泌蛋白基因表达，减少进入内质网的蛋白量，保证内质网的自体稳定性。该反馈抑制机制与UPR信号途径的相关性以及其关键成分仍是尚未解决的科学问题。本课题基于前期研究基础上,采用SAGE技术建立内质网压力下米曲霉数字化全转录谱,系统分析各种内质网压力下对米曲霉蛋白分泌途径及分泌蛋白的表达影响。重点研究丝状真菌的分泌压力反馈机制与UPR关键成分的相关性，对比分析分泌蛋白mRNA稳定性、葡萄阻遏以及翻译水平的调控与分泌压力抑制,并解析其相应的关键功能成分,系统探索丝状真菌蛋白分泌途径及其分泌压力反馈机制。

丝状真菌生产蛋白的瓶颈在于分泌途径中内质网蛋白折叠和修饰。在内质网中蛋白生产质量是主要由非折叠蛋白应答机制(UPR)控制，并通过丝状真菌特有的分泌压力反馈机制(RESS)调控,内质网压力下分泌蛋白基因转录水平的反馈抑制。但RESS 反馈机制及其关键成分仍是尚未解决的科学问题。.基于RNA-seq技术进行全基因组水平的解析了米曲霉基因组的转录体结构，重注释米曲霉RIB基因组，发现丝状真菌中存在大量的可变剪切现象。内质网压力下米曲霉蛋白分泌途径的转录谱研究显示丝状真菌米曲霉在固体培养方式下其蛋白合成与修饰、能量代谢比液体培养方式更强大，并且在内质网压力下丝状真菌米曲霉在固体培养方式下其非折叠蛋白信号调控能力也比液体培养方式更强。验证大量分泌蛋白基因的转录在内质网压力受到明显地抑制，同时发现内质网压力胁迫下，米曲霉细胞内蛋白质的翻译过程受到抑制，从而缓解内质网中蛋白分泌的压力。但内质网压力下非折叠蛋白反馈机制（UPR）关键成分hacA和葡萄糖阻遏效应（Cre）的没有相关性。.以米曲霉外分泌蛋白淀粉酶及其启动子为研究模式，通过启动子截断分析发现TAKA-amylaseB的启动子-377—-290的区域是RESS的顺式效应区域。缺失该顺式成分（87bp）全长启动子分析进一步确认该整个顺式成分是RESS的顺式效应区域。淀粉酶启动子的RESS效应顺式成分为-377—-290bp（87bp）中CAATbox区域是与介导基因表达最为显著的功能区域，其反式结合因子为Hap复合物中HapC、HapE和HapB蛋白亚基基因在内质网压力下转录下调。RNAi干扰抑制hapC基因表达，米曲霉外分泌蛋白淀粉酶和报道基因脂肪酶转录抑制与RESS效应类似，推导反式复合物HapECB转录抑制介导内质网压力下引起胞外分泌蛋白基因的转录受到反馈抑制。