大黄鱼抗菌肽piscidin-like的抗虫特性与作用机制研究

刺激隐核虫病及细菌性继发感染的防治是大黄鱼乃至海水鱼类养殖的重大产业技术难题，常规化学药物不仅难于有效遏制该病在养殖海区的季节性流行暴发，还会带来水产品安全和环境污染等严重问题，故探寻绿色安全的新型杀虫物质是海水鱼类养殖业健康持续发展的重大科技需求。本项目首次提出开展我国海洋鱼类抗菌肽的抗虫功能研究。拟在本项目组前期工作基础上，通过重组DNA技术构建基因工程表达载体，表达纯化大黄鱼抗菌肽piscidin-like成熟肽的重组多肽，研究其杀虫特性、抗虫机制、抗菌活性、溶血活性和协同杀虫效果等。研究结果不仅将阐明大黄鱼piscidin-like免疫应答机制和杀虫机理等理论问题，还将首次利用大黄鱼抗菌肽基因资源库研发大黄鱼自身的抗虫肽资源，为养殖大黄鱼刺激隐核虫病的防治提供既杀虫又抗菌的新型抗虫肽奠定基础，更为我国海水养殖鱼类日趋严重的寄生虫病提供新的绿色安全的防治途径。

针对刺激隐核虫病及细菌性继发感染等大黄鱼养殖过程中的重大产业技术难题，本项目首次从海水鱼类自身发现了具有杀灭刺激隐核虫的抗菌肽piscidin-like,继而实现了piscidin-like在PET表达系统中的融合表达。不仅揭示了piscidin-like的杀虫特性、抗虫机制、抗菌活性、溶血活性和协同杀虫效果等,还分析了大黄鱼piscidin-like免疫应答机制。主要的研究结果如下:.(1) 利用与pET32a表达载体融合构建大黄鱼piscidin-like基因工程表达载体，在E.coli BL21（DE3）中融合表达，再通过Ni-NTA柱纯化，获得了纯度较高的重组蛋白。.(2) piscidin-like抗菌肽能够有效抑制并杀灭试验中所有革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，对革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌。.(3)piscidin-like抗菌肽对刺激隐核虫有较强的杀灭效果:较低浓度（6µM）在短时间内即可杀死全部的刺激隐核虫幼虫和大多数滋养体；较高浓度(72 µM )Pc-pis-His在短时间内（1 h）能够有效杀死大部分早期包囊和全部晚期包囊，表明刺激隐核虫包囊比幼虫和滋养体更难杀灭。.(4) 抗生素与Pc-pis-His在体外具有协同抑菌效果: Pc-pis-His与利福平联合使用时，对金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌的抑菌效果分别呈协同和部分协同作用；Pc-pis-His与链霉素、环丙沙星联合使用时，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果分别是协同和部分协同作用。Pc-pis-His与卡那霉素、四环素和强力霉素联合使用时，对金黄色葡萄球菌的抑制活性为无关作用。Pc-pis-His与链霉素、环丙沙星、卡那霉素、四环素和庆大霉素联合使用时，对哈维氏弧菌的抑制效果也表现为无关作用。.(5)刺激隐核虫的感染能诱导大黄鱼体内piscidin-like的免疫应答，自感染6 h始在所有检测组织中均显著上调。.(7)通过抗菌肽的分子设计获得人工改造肽Pc-pis-His, 其抗菌活性和抗寄生虫活性显著高于未改造的抗菌肽Pc-piscidin。.研究结果为养殖大黄鱼刺激隐核虫病的防治提供既杀虫又抗菌的新型抗虫肽奠定基础，更为我国海水养殖鱼类日趋严重的寄生虫病提供新的绿色安全的防治途径。