ClC-3在成骨细胞力学信号传导中的作用

ClC-3为电压门控氯通道之一，早先被定义为容积敏感氯通道；近年研究表明ClC-3的作用不仅仅局限于细胞容积调控，它与细胞增殖、凋亡、破骨细胞的细胞内酸化调节等相关。成骨细胞在力学刺激下，伴随细胞容积的变化，是否ClC-3介导了这种变化还不清楚。本项目通过细胞体外培养、体外加力实验、siRNA、荧光物质示踪、免疫共沉淀等技术探讨ClC-3作为力学刺激敏感氯通道的可能性。同时还将揭示ClC-3通过调节细胞内酸碱平衡影响参与成骨细胞生长的Wnt、TGF-beta、Runx2等信号途径。本项目旨在借助于细胞生理学等方面的新近研究结果，给予成骨细胞力学信号转导机制新的解释；同时也将探索ClC-3的新功能，为未来使用离子通道药物治疗相关骨疾病奠定基础。

骨组织对力学刺激特别敏感，能够感受到各种化学和力学信号的传导，而且成骨细胞的细胞形态、分化和增殖也均与力学刺激相关。有许多因素调控了骨组织的改建和重塑过程，由于ClC 氯通道基因突变能够导致一些骨相关的遗传病，许多学者开始关注氯通道在成骨中的作用。ClC-3是氯通道基因家庭中的重要分子，主要存在于细胞的内体系统。本研究通过观察力学刺激下成骨细胞ClC-3氯通道的变化，以期探讨ClC-3氯通道参与成骨细胞力学信号传导的可能机制。主要有以下结论：.一、通过对 MC3T3-E1 细胞给予1atm持续性静压力刺激，分别刺激8h、24h后，real time PCR检测，观察到成骨相关因子Alp、Ocn、Bsp的mRNA水平有明显升高，提示力学刺激能够影响成骨细胞的分化，成功建立了加压模型。.二、给MC3T3-E1 细胞持续性静压力刺激后，real time PCR检测了相关信号通路分子mRNA水平，发现Runx2，β-catenin，Lrp6的mRNA水平都相对升高，Pvrl在压力刺激后变化不明显，但Tgf-β在受力后，表达量降低，表现出与力学刺激呈负相关。表明Tgf-β能够与Wnt信号通路交互作用,共同参与细胞的发育和分化。成骨细胞受到压力负荷后，可使其内部的信号通路激活，调节其基因表达，最终影响骨改建。.三、将MC3T3-E1 细胞力学刺激后，其ClC-3氯通道mRNA水平显著升高，提示ClC-3氯通道对力学刺激敏感。并用免疫荧光染色方法，在蛋白水平印证了这一结果。利用基因转染的方法对Clcn3基因上调或下调，成骨相关基因及部分信号通路分子表达水平也相应升高或降低，这就从正反两个方面说明了ClC-3氯通道能够促进成骨相关基因的表达，从而能够促进细胞的成骨分化过程。当转染后再对细胞施以静压力刺激，过表达后载荷时，相关基因mRNA水平表达显著增高，而干涉后载荷时，mRNA水平也相对升高，恢复到相当对照组的水平，这可能是由转染效率的影响。这个结果明确提示一定的力学刺激环境可以激活成骨细胞ClC-3氯通道，后者可以调节成骨相关基因及细胞内的信号通路，平衡成骨和破骨关系，最终影响骨的改建。