BDNF-integrinβ1通路协同增强骨折愈合过程中成骨细胞迁移机制研究

No-union of bone fracture is a common serious problem in clinical orthopedics. Osteoblast migration is a key step for bone healing. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) is an important protein in bone metabolism and repair. Our previous studies have proved that BDNF participated in apoptosis and VEGF release from osteoblasts during fracture healing. However, there is no relevant research of BDNF in osteoblast migration. As adherent cells, integrin signaling plays a synergy role in osteoblast migration. Our preliminary experiments revealed that BDNF promoted integrin β1 expression in osteoblasts and then enhanced its migration. But the mechanism is still unkown. Therefore, We will explore the synergy function of BDNF and integrin β1 by immunoblotting, immunoprecipitation, immunofluorescence, Micro-CT and adenovirus infection and uncover the signaling pathway of BDNF in elevating integrin β1 expression and afterwards enhancing osteoblast migration in vitro and in vivo. To reveal the synergy effect of BDNF and integrin β1 on osteoblast migration, not only can understand the mechanism of bone healing processes but also can prevent and treat the non-union of bone fracture.

骨折不愈合一直是骨科临床的难题。目前研究普遍认为：贯穿于愈合过程中的成骨细胞迁移是骨折愈合的关键。BDNF是骨代谢和骨修复的重要调节蛋白，我们已证实其参与骨折愈合过程中成骨细胞凋亡及VEGF合成及分泌，但对成骨迁移的影响目前尚无相关研究。作为贴壁细胞，成骨细胞迁移往往需要整合素通路协同调控。我们的前期实验发现integrin β1在BDNF刺激的成骨细胞中表达增加，并进一步增强BDNF诱导的细胞迁移效应，但具体机制不详。本研究拟采用小鼠原代成骨细胞和骨折动物模型，通过免疫印记、免疫荧光、免疫共沉淀、免疫组化，Micro-CT和腺病毒感染等方法探讨BDNF-integrin β1协同增强成骨细胞迁移的机制及对骨折愈合的影响，明确BDNF调节integrin β1表达，及其表达上调后增强成骨细胞迁移的信号机制。此研究可丰富对骨折愈合的认识，为临床治疗骨折不愈合提供理论依据。

骨折不愈合一直是骨科临床的难题。贯穿于愈合过程中的成骨细胞迁移是骨折愈合的关键。BDNF是骨代谢和骨修复的重要调节蛋白，但对成骨迁移的效应目前尚无相关研究。作为贴壁细胞，成骨细胞迁移往往需要整合素通路协同调控。我们的前期实验发现integrin β1在BDNF刺激的成骨细胞中表达增加，并增强BDNF诱导的细胞迁移效应，但机制不详。. 本研究通过免疫印记、免疫荧光、免疫共沉淀、免疫组化，Micro-CT和腺病毒感染等方法探讨BDNF-integrin β1协同增强成骨细胞迁移的机制。主要研究结果如下：1.使用BDNF刺激成骨细胞后integrin β1表达水平逐渐升高，提示BDNF通过促进integrin β1表达而增强成骨细胞迁移；2.BDNF和Fibronectin (integrin β1的配体)分别作于成骨细胞，均能明显促进成骨细胞的迁移，但BDNF+Fibronectin的效应最高，说明BDNF和integrin β1在促成骨细胞迁移上存在协同作用；3.使用TrkB的抑制剂K252a和integrin β1的封闭抗体作用成骨细胞，K252a和和integrin β1的封闭抗体均可以明显抑制成骨细胞迁移，说明BDNF通过TrkB-integrin β1影响成骨细胞迁移；4.使用TrkB, ERK1/2和AKT抑制剂K252a, PD98059和LY294002作用于成骨细胞，均可明显抑制成骨细胞迁移；K252a可以明显抑制ERK1/2和AKT的活性，PD98059仅抑制ERK1/2的活性，LY294002仅抑制AKT的活性，说明ERK1/2和AKT是两条并行的信号通路。5.在股骨干闭合骨折模型中，integrin β1干扰腺病毒组明显抑制骨折早期和中期愈合，并影响Runx2的表达。通过上述研究结果，明确BDNF通过TrkB/ERK1/2-AKT1/2/integirn β1通路调控成骨细胞迁移，并影响骨折的早期和中期愈合。. 此外，利用磷酸化蛋白质组学技术，我们筛选出Nucks1为BDNF/TrkB信号通路调控integirn β1表达的关键信号蛋白，初步实验证实其在BDNF刺激下磷酸化增强且Nucks1-siRNA明显抑制成骨细胞迁移和integirn β1表达。