单核细胞增多症李斯特菌内化素基因缺失株对绵羊血脑屏障作用机制的研究

Listeria monocytogenes (Referred to as LM) is an important zoonotic foodborne pathogens,which can cause gastroenteritis, septicemia, meningoencephalitis and abortion etc. Listeria monocytogenes will be seized as one of the foodborne pathogens by the WHO food safety work plan in 2000 . Sheep is the most susceptible in all the animals, so far, the mechanism that LM how to through the blood-brain barrier and cause the meningoencephalitis is still unclear. Internalin is the main factor of adhesioa and invasion of Lm. This study intends to establish a blood-brain barrier model of sheep in vitro. LM 4b type isolates 681, L10, SB2, 125SL1 (later two are sheep encephalitis clinical isolates) and a natural lack of InlAB S10 strain are as the parental strains .we will build InlC single deletion mutant strain of SB2, 125SL1, 681 and L10 on the basis of the present work, Furthermore, build InlAB of with InlC pairs missing mutant strain .This study focusing on InlC the role of LM in througing the blood-brain barrier and it's effect on virulence. The results will reveal the influence of InlC to bacteria pathogenic,which can lay the foundation for further elucidate the pathogenic mechanism of L. monocytogenes.

单核细胞增多症李斯特菌（简称Lm）是重要的人兽共患食源性病原菌，可引发胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等，2000年被WHO食品安全工作计划列为必检的食源性病原菌之一。在动物中绵羊最易感，目前为止，LM如何通过血脑屏障致脑膜脑炎的机制还不甚清楚，而内化素是Lm黏附和侵袭的主要因子。本研究拟建立绵羊体外血脑屏障模型，以Lm的4b型的分离株681、L10、SB2、125SL1（后两株均为绵羊脑炎临床分离株）和天然缺失InlAB 的S10为亲本株，构建InlC单缺失突变株，SB2、125SL1、681和L10的InlAB与InlC双缺失突变株，着重研究InlC在细菌感染中通过宿主血脑屏障和对细菌毒力的影响。研究结果可揭示InlC对细菌致病性的影响，为进一步阐明单增李斯特菌的致病机理奠定基础。

单核细胞增多症李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的人畜共患食源性病原菌,能引起人和动物的脑膜炎致死率达20-30%。本研究拟培养脑微血管内皮细胞，建立绵羊体外血脑屏障模型，以4b型食源性LM681及临床绵羊脑炎分离株LM90(SB2)为亲本株，构建inlA、inlB和inlC基因单缺失突变株及InlAB与InlC双缺失突变株，通过Lm及突变株菌对绵羊体外血脑屏障模型侵染试验实验动物的致病性试验，着重研究重要内化素因子在Lm感染中通过宿主血脑屏障和对细菌毒力的影响。揭示内化素因子对Lm致病性的影响，为阐明单增李斯特菌的致病机理奠定基础。成功构建了LM90和LM681的内化素inlA、inlB、inlC、inlJ基因缺失的八株单基因缺失株，以亲本株为对照，inlA、inlB、inlC及inlJ基因突变株对小鼠LD50高出101.5 、101.3 、101.30及101.33倍,但差异不显著；LM681△InlAB、LM90△InlAB双基因缺失突变株、LM681△InlABC三基因缺失突变株, 与亲本株LM681相比，LM681△InlABC的毒力降低了3个数量级，LM681△InlAB的毒力降低了2个数量级，LM681△InlA和LM681△InlB的毒力均下降1个数量级； InlB的缺失降低了LM在肝脏和脑组织中的载菌量，InlA的缺失降低了LM在脾脏中的增殖，InlC能够协同InlA和InlB介导LM在肝脏、脾脏和脑组织中的增殖。细胞免疫荧光结果表明：InlB能够影响MBMEC细胞骨架重塑，InlA影响次之，而InlC和InlJ在此过程中影响较小或没影响。LM可引起细胞间紧密连接改变，但InlA、InlB、InlC和InlJ在该过程中可能不发挥作用。建立了绵羊体外血脑屏障模型，这为其他相关同类疾病的研究提供了真实有效的技术平台，具有十分重要的临床意义。在LM侵染试验中，仅LM亲本株穿越血脑屏障生长出菌落。而在LM绵羊体内感染实验中也只有Lm亲本株菌组的绵羊发病并从脑部分离到李斯特菌。以上研究结果表明InlA、lnlB、InlC在李斯特菌致病力的作用方面，相互协同，共同作用。这为研究内化素在LM毒力、基因调控和穿越血脑屏障造成脑膜炎的分子机制提供了科学参考依据。同时也为LM缺失株疫苗的研究选择提供了科学数据。